If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Ако си зад уеб филтър, моля, увери се, че домейните *. kastatic.org и *. kasandbox.org са разрешени.

Основно съдържание

Бактериална трансформация & селекция

Трансфер на плазмидна ДНК в бактерии. Как се избират бактериите. Производство и пречистване на протеини.

Ключови точки:

  • Бактериите могат да приемат чужда ДНК в процес, наречен трансформация.
  • Трансформацията е ключова стъпка в ДНК клонирането. Случва се след рестриктивно смилане и лигиране и въвеждане на новосъздадените плазмиди в бактерии.
  • След трансформация бактериите биват сортирани на антибиотични плаки. Бактериите с плазмид са резистентни към антибиотика и всяка от тях ще образува колония.
  • Колониите с правилния плазмид могат да се отглеждат да създадат по-големи култури идентични бактерии, които са използвани за производство на плазмид или за създаване на протеин.

Голямата картина: ДНК клониране

Трансформацията и подбора на бактерии са ключови стъпки в ДНК клонирането. ДНК клониране е процесът на изработване на много копия на специфичен участък от ДНК, например на един ген. Копията често са направени в бактерии.
В един типичен експеримент с клониране, изследователите първо вмъкват част ДНК, като ген, в кръгова част ДНК, наречена плазмид. Тази стъпка използва ограничителни ензими и ДНК лигаза и се нарича лигиране.
Следващата стъпка след лигирането е да се прехвърли ДНК-то в бактерии в процес, наречен трансформация. После се използва антибиотичен подбор и методи за анализ на ДНК, за да се идентифицират бактериите, които съдържат плазмида, който търсим.

Стъпки на бактериална трансформация и подбор

Това е една типична процедура за трансформиране и подбор на бактерии:
  1. Специално приготвени бактерии се смесват с ДНК (напр. от лигиране).
  2. Бактериите се подлагат на топлинен шок, който кара част от тях да приемат плазмид.
  3. Плазмидите, използвани в клонирането, съдържат ген за антибиотична резистентност. Ето защо всички бактерии се поставят на антибиотична плака, за да се изберат тези, които са приели плазмид.
  1. Бактериите без плазмид умират. Всяка бактерия с плазмид полага начало на група идентични, съдържащи плазмид бактерии, наречени колония.
  2. Няколко колонии се проверяват, за да се идентифицира колония с правилния плазмид (например чрез PCR или рестриктивно смилане).
  3. Колония, съдържаща правилния плазмид, се отглежда и се използва за производство на плазмид или протеин.

Защо трябва да проверяваме колониите?

Всички бактерии, които създават колонии, трябва да съдържат плазмид (който осигурява антибиотична резистентност). Но не винаги всички съдържащи плазмид колонии ще имат един и същ плазмид.
Как работи това? Когато изрежем и поставим ДНК, често е възможно да се образуват странични продукти освен плазмида, който сме възнамерявали да изградим. Например, когато опитаме да вмъкнем един ген в един плазмид, като използваме определен рестриктивен ензим, може да има случаи, при които плазмидът отново се затваря (без да приеме гена), и други случаи, при които генът влиза наобратно.
Защо има значение дали генът влиза наобратно? В някои случаи няма. Но ако искаме да експресираме гена в бактериите, за да синтезираме един протеин, генът трябва да сочи в правилната посока спрямо промотора, или контролната последователност, която води до генна експресия. Ако генът е наобратно, ще се транскрибира грешната верига ДНК и няма да получим желания протеин.
Поради тези възможни варанти е важно да събирем плазмидна ДНК от всяка колония и да видим дали съвпада с плазмида, който опитваме да създадем. Често се използват рестриктивни смилания, PCR и ДНК секвениране, за да се анализира плазмидната ДНК от бактериалните колонии.

Производство на протеин в бактерии

Приеми, че идентифицираме една колония с "добър" плазмид. Какво се случва след това? Каква е целта на цялото това трансформиране, подбиране и анализиране?

Възможност 1: Бактерии = фабрики за плазмиди

В някои случаи бактериите просто се използват като "фабрики за плазмиди", като създават много плазмидно ДНК. Плазмидното ДНК може да бъде използвано за следващи стъпки в ДНК клонирането (например за изграждане на по-сложни плазмиди) или в различни видове експерименти.
В някои случаи плазмидите директно се използват за практически цели. Например плазмиди са били използвани за доставяне на човешки ген в белодробна тъкан в скорошно клинично изпитване на генна терапия при пациенти с генетичното разстройство цистична фиброза.

Възможност 2: Бактерии = фабрики за протеин

В други случаи бактериите могат да бъдат използвани като фабрики за протеин. Ако един плазмид съдържа правилните контролни последователности, бактериите могат да бъдат индуцирани да експресират гена, който съдържат, когато се добави химичен сигнал. Експресията на гена води до производство на иРНК, която се транслира в протеин. Бактериите могат да бъдат лизирани (отворени), за да освободят протеина.
Бактериите съдържат много протеини и макромолекули. Поради това новосинтезираният протеин трябва да бъде пречистен (отделен от другите протеини и макромолекули), преди да може да бъде използван. Има разнообразие от различни техники, които се използват за пречистване на протеин.
В една техника, наречена афинитетна хроматография, смес от молекули, извлечени от лизираните бактерии, се пропускат през колона, или цилиндър, пълен със зрънца. Зрънцата са обвити с антитяло, протеин от имунната система, който се прикрепя специфично към една целева молекула.
Антитялото в колоната е проектирано да се свърже с интересуващия ни протеин и с никоя друга молекула в сместа. Следователно интересуващият ни протеин остава в колоната, докато другите молекули биват отмити. В последната стъпка интересуващият ни протеин се освобождава от колоната и се събира за употреба.

Разгледай темата извън Кан Академия

Искаш да научиш повече за бактериалната трансформация? Виж тази симулация от LabXchange.
Искаш да научиш повече за селекцията на трансформирани бактерии? Виж тази симулация от LabXchange.
LabXchange е безплатна, научно-образователна онлайн платформа, създадена от факултета по изкуства и науки на университета Харвард с подкрепата на фондация Amgen.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Все още няма публикации.
Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.