Основно съдържание

Курс: Биологична библиотека > Раздел 20

Урок 2: Клониране на ДНК

Преглед: Клониране на ДНК

Дефиниция, цел и основни стъпки на клонирането на ДНК

Ключови точки:

ДНК клониране е техника от молекулярната биология, която създава много идентични копия на някаква част от ДНК, например един ген.
В типичен експеримент на клониране даден целеви ген се вмъква в кръгова ДНК, наречена плазмид.
Плазмидът се въвежда в бактериите чрез процес, наречен трансформация, и бактериите, носещи плазмида, се избират чрез използване на антибиотици.
Бактериите с правилния плазмид се използват за създаване на още плазмидни ДНК или, в някои случаи, за експресиране на гена и синтез на съответния протеин.

Въведение

Когато чуеш думата "клониране", може би се сещаш за клонирането на цели организми, например като овцата Доли. Да клонираш един организъм означава да направиш негово точно генетично копие. В лабораториите по молекулярна биология най-често се клонира един ген или друга малка част ДНК.

Ако приятелката ти, молекулярна биоложка, каже, че нейното "клониране" не работи, тя почти със сигурност говори за копиране на части от ДНК, не за създаването на следващата Доли!

Преглед на ДНК клонирането

ДНК клониране е процесът на създаване на множество идентични копия на някакъв определен участък от ДНК. Обикновено при клониране на ДНК генът или друг интересуващ ни ДНК фрагмент (вероятно ген за медицински важен човешки протеин) първо се вмъква в кръгова ДНК, наречена плазмид. Вмъкването се извършва чрез използване на ензими, които "изрязват и поставят" ДНК, и и по този начин се получава молекула рекомбинантна ДНК, или ДНК, съставена от фрагменти от множество източници.

След това рекомбинантният плазмид бива се въвежда в бактерии. Бактериите, носещи плазмида, се селектират и отглеждат. При репродуцирането си те репликират плазмида и го предават на поколението си, създавайки копия от ДНК-то, което съдържа.

Каква е целта от създаването на много копия от една ДНК последователност в един плазмид? В някои случаи ни трябват доста ДНК копия, за да проведем експерименти или да изградим нови плазмиди. В други случаи участъкът от ДНК кодира полезен протеин и бактериите се използват като "фабрики" за неговия синтез. Например човешкият ген за инсулина се експресира от бактерии E. coli за производство на инсулин, използван от диабетиците.

Както може да знаеш, ако имаш приятели или членове на семейството, които са диабетици, хормонът инсулин играе важна роля за човешкото здраве. В тялото на един здрав човек инсулинът се произвежда в панкреаса. Той пътува през кръвообращението и се прикрепя към клетки от тялото, позволявайки им да приемат захарта глюкоза.

При човек с диабет тип 1, клетките на панкреаса, които произвеждат инсулин, са увредени или разрушени. Хората с диабет тип 1 трябва редовно да си инжектират инсулин от друг източник, за да предотвратят опасно високи нива на кръвна захар (и да позволят на захарите да навлязат в клетките на тялото като гориво).

Дълги години цялото количество инсулин, използвано от хора с диабет тип 1, се получаваше от панкреасите на прасета и крави, които са били заклани за месо. Инсулиновата молекула е подобна при хората, прасетата и кравите, така че инсулин от прасе или крава може да замести човешкия инсулин в организма на хората с диабет тип 1.

Но от 80-е години на 20-и век учените са развили нови техники за производство на човешки инсулин с използването на бактерии Escherichia coli (E. coli). Като цяло, те превърнали бактериите в малки фабрики, произвеждащи инсулин. Този рекомбинантен инсулин, или инсулин, направен от комбиниране на ДНК от множество източници (хора и бактерии), сега е основното лечение, използвано от хората с диабет тип 1.

Стъпки на ДНК клониране

ДНК клонирането се използва за много цели. Като пример да разгледаме как ДНК клонирането може да се използва за синтезиране на протеин (като човешки инсулин) в бактериите. Основните стъпки са:

Отваряне на плазмида и "поставяне" на гена. Този процес разчита на рестриктивни ензими (които изрязват ДНК) и ДНК лигаза (която съединява ДНК).
Вмъкване на плазмида в бактерии. Използване на подбор с помощта на антибиотици за идентифициране на бактериите, които са приели плазмида.
Отглеждане на голям брой бактерии, носещи плазмида, и използване на тези бактерии като "фабрики" за производство на протеина. Извличане на протеина от бактериите и пречистване на протеина.

Нека разгледаме по-отблизо всяка стъпка.

1. Изрязване и поставяне на ДНК

Как ДНК фрагменти от различни източници могат да бъдат съединени? Често използван метод включва използването на два вида ензими: рестриктивни ензими (рестриктази) и ДНК лигаза.

Един рестриктивен ензим е ензим, който срязва ДНК, като разпознава специфична целева последователност и изрязва ДНК на две части близо до или на това място. Много рестриктивни ензими изрязват краища с къси, еднонишкови увисвания. Ако две молекули имат съвпадащи увисвания, те могат да съчетаят базите си и да се прикрепят една към друга. Но те ще се комбинират, за да образуват цяла ДНК молекула, когато бъдат "слепени" от ДНК лигаза, която запълва празнините в гръбнака на ДНК.

Целта ни при клонирането е да вмъкнем един целеви ген (например за човешки инсулин) в един плазмид. Използвайки внимателно избран рестриктивен ензим, разграждаме:

Плазмида, който се срязва на едно единствено място
Целевия генен фрагмент, при който има срязване близо до всеки край

После комбинираме фрагментите с ДНК лигаза, която ги свързва, за да създаде рекомбинантен плазмид, съдържащ гена.

2. Бактериална трансформация и подбор

Плазмиди и друга ДНК могат да бъдат въведени в безвредни бактерии като E. coli, използвани в лаборатории, в процес, наречен трансформация. По време на трансформацията специално подготвени бактериални клетки се подлагат на шок (като висока температура), който способства те да приемат чужда ДНК.

Чудесен въпрос! Странно, но никой не е напълно сигурен какъв е отговорът, въпреки че трансформацията с топлинен шок е много често използвана техника в молекулярната биология. Като цяло се смята, че топлинният шок променя течливостта на мембраната и/или създава пори (дупки), което улеснява преминаването на ДНК и навлизането ѝ в клетката

^{1}

В плазмида обикновено се добавя ген на антибиотична резистентност, който позволява бактериите да оцелеят при наличието на специфичен антибиотик. Следователно бактерията, която е приела плазмида, може да бъде селектирана в хранителните плаки, съдържащи антибиотика. Бактериите без плазмида умират, докато бактериите, които носят плазмида, могат да оцелеят и да се възпроизведат. Всяка оцеляла бактерия дава начало на малка група, или колония, от идентични бактерии, които са носители на този плазмид.

Не всички колонии задължително ще съдържат точния плазмид. Възможно е по време на лигирането (съединяването) ДНК фрагментите не винаги да бъдат "поставени" точно по начина, по който възнамеряваме. Ето защо трябва да съберем ДНК от няколко колонии и да видим дали всяка съдържа точния плазмид. Методи като срязване с рестриктивен ензим и PCR често се използват за проверка на плазмидите.

3. Производство на протеин

След като намерим бактериална колония с правилния плазмид, можем да отгледаме голяма култура от носещи плазмид бактерии. След това пускаме на бактериите химичен сигнал, който ги инструктира да произведат целевия протеин.

Бактериите служат като миниатюрни "фабрики", произвеждащи големи количества протеин. Например, ако нашият плазмид е съдържал гена на човешкия инсулин, бактериите ще започнат да транскрибират гена и да го транслират в иРНК, за да произведат много молекули от протеина човешки инсулин.

Хората и бактериите споделят един и същ генетичен код, което означава, че един човешки ген може да бъде транскрибиран и транслитериран от бактерии.

Но за да може един човешки ген да бъде експресиран от бактерии, трябва да има една важна модификация. По-точно трябва да няма интрони. Интроните са прекъсващите поредици, които са намират в много човешки гени и се премахват от еукариотните РНК транскрипти чрез изрязване, за да се създаде зряла иРНК. Бактериите нямат интрони и не могат да изрязват РНК транскрипти.

Как можем да получим версия на човешки ген с премахнати интрони? Свободна от интрони версия на човешки ген може да се получи от иРНК, която кодира гена, като се използва ензима обратна транскриптаза. Обратната транскриптаза синтезира ДНК верига като използва иРНК верига за матрица. След допълнителна стъпка се получава двойноверижна ДНК със свободна от интрони версия на гена (наречена комплементарна ДНК (кДНК)).

След като протеинът бъде произведен, бактериалните клетки могат да бъдат отворени, за да го освободят. Има много други протеини и макромолекули, които плават в бактериите, освен целевия протеин (например инсулин). Поради това целевият протеин трябва да бъдат пречистен, или да се отдели от други съдържими на клетката чрез биохимични техники. Пречистеният протеин може да бъде използван за експерименти или, в случая с инсулина, даден на пациенти.

Ами... и да, и не. Рекомбинантният инсулин, произвеждан от фармацевтичните компании, всъщност се синтезира от бактерии и се експресира от плазмид, който носи модифициран ген на човешкия инсулин. Инсулинът, синтезиран от бактериите, се пречиства с помощта на вид колонно пречистване.

Но получаването на биологично активен инсулин изисква някои допълнителни стъпки. Инсулинът е синтезиран като една единствена полипептидва верига. Но трябва да се образуват дисулфидни връзки във веригата и част от нея трябва да бъде откъсната, за да се образуват две отделни вериги (задържани само от дисулфидните връзки). Чак тогава инсулинът е биологично активен, тоест, способен да действа като хормон в тялото на пациента.

Производството на инсулин, който може да бъде използван от диабетиците, изисква тези допълнителни стъпки да бъдат включени в процедурата на пречистване на протеина, така че инсулин да добие правилната си триизмерна форма.

Употреби на ДНК клонирането

ДНК молекулите, създадени чрез техники на клониране, се използват за много цели в молекулярната биология. Кратък списък с примери включва:

Биолекарства. ДНК клонирането може да се използва за създаване на човешки протеини с биомедицински приложения като инсулина, споменат по-горе. Други примери за рекомбинантни протеини включват човешкия хормон на растежа, който се дава на пациенти, които не могат да синтезират хормона, и тъканен плазминоген активатор (tPA), който се използва за лечение на инсулти и предотвратяване на съсиреци. Рекомбинантните протеини като тези често се синтезират в бактерии.
Генна терапия. При някои генетични заболявания на пациентите им липсва функционалната форма на един определен ген. С помощта на генната терапия се прави опит да се осигури нормално копие на гена в клетките на тялото на пациента. Например ДНК клонирането е било използвано за изграждане на плазмиди, които съдържат нормална версия на гена, който е нефункционален при цистична фиброза. Когато плазмидите били доставени в клетките на белите дробове на пациенти с цистична фиброза, функцията на белия дроб се влошавала по-бавно $^{2}$ ‍.
Генен анализ. В обикновените изследователски лаборатории биолозите често използват ДНК клониране, за да изградят изкуствени, рекомбинантни версии на гени, които им помагат да разберат как функционират нормалните гени в организма.
Например изследователите, които проучват неврони в плодовите мушици, може да използват ДНК клониране, за да съставят докладна конструкция за един неутрален ген. В тази конструкция регулаторният участък (промотор) на гена може да бъде поставен пред един ген, кодиращ флуоресцентен протеин. Когато се прехвърли в мушица, "докладният ген" ще бъде експресиран в същите неврони като неутралния ген, водейки до това, че двата неврона ще блестят (флуоресцират) под UV светлина.

Това са просто няколко примера за това как днес се използва ДНК клонирането. ДНК клонирането е много често използвана техника на молекулярната биология с множество приложения.

Разгледай темата извън Кан Академия

Искаш да научиш повече за рестриктивните ензими? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.

Искаш да научиш повече за ролята на ДНК лигазата в генното клониране? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.

Искаш да научиш повече за бактериалната трансформация? Виж тази симулация от LabXchange.

Искаш да научиш повече за селекцията на трансформирани бактерии? Виж тази симулация от LabXchange.

LabXchange е безплатна, научно-образователна онлайн платформа, създадена от факултета по изкуства и науки на университета Харвард с подкрепата на фондация Amgen.

Тази статия е лицензирана под разрешително CC BY-NC-SA 4.0.

Цитирани трудове:

Супербест. (11 юни 2014). Как работи трансформацията с топлинен шок? В Biology stack exchange. Взето от http://biology.stackexchange.com/questions/19038/how-does-heat-shock-transformation-work.
Алтън, Е. У. Ф. У., Армстронг, Д. К., Ашби, Д., Бейфийлд, К. Дж., Билтън, Диана, Блумфийлд, Е. В., … Востенхолм-Хог, П. (2015). Повтаряща се небулизация на невирусна CFTR терапия при пациенти с цистична фиброза: Случайно, двойно сляпо, плацебо-контролирано, фаза 2b изпитване. Дихателна медицина на Ланцет, 3(9), 684-691. http://dx.doi.org/10.1016/S2213-2600(15)00245-3.

Допълнителни препратки:

Афибоди. (n.d.). Получаване на инсулин от човешки серум. Взето от http://affibody.com/upload/Research%20Reagents/Application%20notes/Insulin%20AFF%20application%20note%202007-03-30.pdf.

Amgen Biotech Experience. (2015). Студентски наръчник. Взето от https://www.amgenbiotechexperience.com/sites/abe.edc.org/files/abe_english_student_all_sequences_05.15.15.pdf.

Биотехнологии. (23 март 2016). Взето на 29 март 2016 от Уикипедия: https://en.wikipedia.org/wiki/Biotechnology.

Гебел, Е. (2013). Изработване на инсулин: поглед зад кулисите на произвеждането на животоспасяващо лекарство. В Диабетна прогноза. Взето от http://www.diabetesforecast.org/2013/jul/making-insulin.html?referrer=https://www.google.com/.

Напредък в генната терапия на цистична фиброза. (3 юли 2015). В NHS choices. Взето от http://www.nhs.uk/news/2015/07July/Pages/Gene-therapy-breakthrough-for-cystic-fibrosis.aspx.

R&D Системи. (2016). Рекомбинантен протеин на човешкия хормон на растежа (GH). В Хормон на растежа. Взето от https://www.rndsystems.com/products/recombinant-human-growth-hormone-gh-protein_1067-gh.

Рийс, Дж. Б., Ъри, Л. А., Кейн, М. Л., Васерман, С. А., Минорски, П. В. и Джаксън, Р. Б. (2011). ДНК инструменти и биотехнология. В Биология на Кампбел (10-то издание, стр. 408-435). Сан Франциско, Калифорния: Pearson.

Уилкин, Д. (23 март 2016). Генно клониране - разширено. В разширени биологични концепции CK-12. Взето от http://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Вписване в профила

Сортирай по:

Все още няма публикации.

Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.