If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Ако си зад уеб филтър, моля, увери се, че домейните *. kastatic.org и *. kasandbox.org са разрешени.

Основно съдържание

Рестрикционни ензими & ДНК лигаза

Ограничено храносмиране. Лепкави краища и тъпи краища. Лигиране - реакции.

Ключови точки:

  • Рестриктивни ензими са ДНК-режещи ензими. Всеки ензим разпознава една или няколко целеви последователности и изрязва ДНК при или близо до тях.
  • Голям брой рестриктивни ензими правят изкривени разрези, водейки до краища с увиснала единична верига ДНК. Но някои правят тъпи краища.
  • ДНК лигаза е ДНК-съединяващ ензим. Ако две части ДНК имат съвпадащи краища, лигазата може да ги свърже, за да образува една единствена непрекъсната молекула ДНК.
  • При клонирането на ДНК се използват рестриктивни ензими и ДНК лигаза за вмъкване на гени и други фрагменти ДНК в плазмиди.

Как можеш да изрежеш и поставиш ДНК?

При ДНК клонирането учените правят много копия на някакъв участък от ДНК, например на един ген. В много случаи клонирането включва вмъкване на гена в кръгова ДНК, наречена плазмид, която може да бъде копирана в бактериите.
Как могат фрагменти ДНК от различни източници (като човешки ген и бактериален плазмид) да бъдат събрани заедно, за да се получи една единствена ДНК молекула? Един често използван метод е с помощта на рестриктивни ензими и ДНК лигаза.
  • Рестриктивен ензим е ДНК-изрязващ ензим, който разпознава специфични места в ДНК. Много рестриктивни ензими правят изкривени разрези при или близо до местата на разпознаване, водейки до краища с едноверижно увисване.
  • Ако две ДНК молекули имат комплементарни краища, те могат да бъдат събрани от ензима ДНК лигаза. ДНК лигаза запълва пролуката между молекулите, образувайки една непрекъсната ДНК верига.
Рестриктивните ензими и ДНК лигазата често се използват за вмъкване на гени и други фрагменти от ДНК в плазмиди по време на ДНК клониране.

Рестриктивни ензими

Рестриктазите (рестриктивни ензими) се срещат в бактериите (и други прокариоти). Те разпознават и се прикрепят към определени последователности на ДНК, наречени рестриктивни места. Всеки рестриктивен ензим разпознава само едно или няколко рестриктивни места. Когато намери целевата си последователност, рестриктивният ензим срязва двете вериги на ДНК молекулата. Обикновено разрезът е при или близо до рестриктивното място и се прави по предвидим начин.
Като пример за това как един рестриктивен ензим разпознава и изрязва една ДНК последователност ще разгледаме EcoRI – често срещан рестриктивен ензим, който се използва в лабораториите. EcoRI изрязва при следното място:
Когато EcoRI разпознае и изреже това място, той винаги прави това по много определен модел, при който се получават краища с едноверижни ДНК "увисвания":
Ако друг участък от ДНК има такова увисване, което може да се съчетае (например, понеже също е била изрязана от EcoRI), увисванията могат да се свържат чрез съчетаване на комплементарните бази. Поради тази причина за ензимите, които оставят едноверижни увисвания, се казва, че произвеждат лепкави краища. Лепкавите краища са полезни при клонирането, понеже могат да свържат два фрагмента ДНК в едно, така че да могат да бъдат съединени от ДНК лигаза.
Не всички рестриктивни ензими произвеждат лепкави краища. Някои са "тъпи резачи", които срязват право през средата на една целева последователност и не оставят увисване. Рестриктивният ензим SmaI е пример за тъп резач:
Фрагментите с тъпи краища също могат да бъдат съединени един към друг от ДНК лигаза. Но фрагментите с тъпи краища са по-трудни за лигиране (свързване) помежду си (реакцията на лигиране е по-неефикасна и е по-вероятно да се провали), понеже няма едноверижни увисвания, които да задържат ДНК молекулите на едно място.

ДНК лигаза

Ако учиш за ДНК репликация, може вече да познаваш ензима ДНК лигаза. При репликацията на ДНК работата на лигазата е да съедини в едно фрагменти от новосинтезирана ДНК, за да образува безупречна нишка. Лигазите, използвани в ДНК клонирането, правят същото нещо. Ако два фрагмента ДНК имат комплементарни краища, ДНК лигазата може да ги свърже в едно, за да направи една молекула.
Как ДНК лигазата прави това? Като използва АТФ като енергиен източник, лигазата катализира реакция, в която фосфатната група, стърчаща от 5’ края на една ДНК верига се свързва с хидроксилната група, стърчаща от 3’ края на другата. Тази реакция води до получаване на една захаро-фосфатна верига.

Пример: Изграждане на рекомбинантен плазмид

Да видим как рестриктивното срязване и лигирането могат да бъдат използвани за вмъкване на един ген в един плазмид. Предположи, че имаме целеви ген, обграден от места за разпознаване на EcoRI, и един плазмид, съдържащ едно единично EcoRI място:
Целта ни е да използваме ензима EcoRI, за да вмъкнем гена в плазмида. Първо отделно срязваме фрагмента и плазмида с EcoRI. В тази стъпка се получават фрагменти с лепкави краища:
След това взимаме генния фрагмент и линеаризирания (отворен) плазмид и ги съединяваме с ДНК лигаза. Лепкавите краища на двата фрагмента се залепят един за друг чрез съчетаването на комплементарните бази:
След като са свързани от лигазата, фрагментите стават една непрекъсната ДНК верига. Целевият ген сега е вмъкнат в плазмида, създавайки рекомбинантен плазмид.

Рестриктивното срязване и лигирането включват много молекули ДНК

В примера по-горе видяхме един резултат от лигиране между един ген и един плазмид, изрязан с EcoRI. Но в точно същото лигиране може да се получат и други резултати. Например изрязаният плазмид може да се затвори отново (да стане отново кръгов), без да приеме гена. Подобно, генът може да влезе в плазмида, но обърнат наобратно (тъй като двата му EcoRI лепкави края са идентични).
Рестриктивните срязвания и лигирания като това се извършват с използване на много копия на плазмидно и генно ДНК. Всъщност милиарди молекули ДНК се използват в едно единично лигиране! Тези молекули се сблъскват една с друга и с ДНК лигазата на случаен принцип по различи начини. Тоест, ако е възможно получаването на някакъв брой различни продукти, всички те ще бъдат направени в някаква степен – включително тези, които не искаме.
Как можем да избегнем "лошите" плазмиди? Когато трансформираме бактерии с ДНК от едно лигиране, всяка взима различна част ДНК. Можем да проверим бактериите след трансформация и да използваме само тези с правилния плазмид. В много случаи плазмид от трансформираните бактерии се анализира с използването на друго рестриктивно срязване, за да видим дали съдържа правилната ДНК последователност с правилната ориентация.

Разгледай темата извън Кан Академия

Искаш да научиш повече за рестриктивните ензими? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.
Искаш да научиш повече за ДНК лигазата? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.
LabXchange е безплатна, научно-образователна онлайн платформа, създадена от факултета по изкуства и науки на университета Харвард с подкрепата на фондация Amgen.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Все още няма публикации.
Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.