If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Ако си зад уеб филтър, моля, увери се, че домейните *. kastatic.org и *. kasandbox.org са разрешени.

Основно съдържание

Рестрикционни ензими & ДНК лигаза

Ограничено храносмиране. Лепкави краища и тъпи краища. Лигиране - реакции.

Ключови точки:

  • Рестриктивни ензими са ДНК-режещи ензими. Всеки ензим разпознава една или няколко целеви последователности и изрязва ДНК при или близо до тях.
  • Голям брой рестриктивни ензими правят изкривени разрези, водейки до краища с увиснала единична верига ДНК. Но някои правят тъпи краища.
  • ДНК лигаза е ДНК-съединяващ ензим. Ако две части ДНК имат съвпадащи краища, лигазата може да ги свърже, за да образува една единствена непрекъсната молекула ДНК.
  • При клонирането на ДНК се използват рестриктивни ензими и ДНК лигаза за вмъкване на гени и други фрагменти ДНК в плазмиди.

Как можеш да изрежеш и поставиш ДНК?

При ДНК клонирането учените правят много копия на някакъв участък от ДНК, например на един ген. В много случаи клонирането включва вмъкване на гена в кръгова ДНК, наречена плазмид, която може да бъде копирана в бактериите.
Как могат фрагменти ДНК от различни източници (като човешки ген и бактериален плазмид) да бъдат събрани заедно, за да се получи една единствена ДНК молекула? Един често използван метод е с помощта на рестриктивни ензими и ДНК лигаза.
  • Рестриктивен ензим е ДНК-изрязващ ензим, който разпознава специфични места в ДНК. Много рестриктивни ензими правят изкривени разрези при или близо до местата на разпознаване, водейки до краища с едноверижно увисване.
  • Ако две ДНК молекули имат комплементарни краища, те могат да бъдат събрани от ензима ДНК лигаза. ДНК лигаза запълва пролуката между молекулите, образувайки една непрекъсната ДНК верига.
Рестриктивните ензими и ДНК лигазата често се използват за вмъкване на гени и други фрагменти от ДНК в плазмиди по време на ДНК клониране.

Рестриктивни ензими

Рестриктазите (рестриктивни ензими) се срещат в бактериите (и други прокариоти). Те разпознават и се прикрепят към определени последователности на ДНК, наречени рестриктивни места. Всеки рестриктивен ензим разпознава само едно или няколко рестриктивни места. Когато намери целевата си последователност, рестриктивният ензим срязва двете вериги на ДНК молекулата. Обикновено разрезът е при или близо до рестриктивното място и се прави по предвидим начин.
Като пример за това как един рестриктивен ензим разпознава и изрязва една ДНК последователност ще разгледаме EcoRI – често срещан рестриктивен ензим, който се използва в лабораториите. EcoRI изрязва при следното място:
5'-...ГААТТЦ...-3' 3'-...ЦТТААГ...-5'
Място на EcoRI
Когато EcoRI разпознае и изреже това място, той винаги прави това по много определен модел, при който се получават краища с едноверижни ДНК "увисвания":
Един EcoRI ензим се прикрепя към EcoRI място във фрагмент от ДНК и срязва двете вериги на ДНК. Моделът на това срязване е:
5'-...Г|ААТТЦ...-3' 3'-...ЦТТАА|Г...-5'
Така се получава увисване от 5'-AATT-3' от всеки край на изрязаната ДНК.
Ако друг участък от ДНК има такова увисване, което може да се съчетае (например, понеже също е била изрязана от EcoRI), увисванията могат да се свържат чрез съчетаване на комплементарните бази. Поради тази причина за ензимите, които оставят едноверижни увисвания, се казва, че произвеждат лепкави краища. Лепкавите краища са полезни при клонирането, понеже могат да свържат два фрагмента ДНК в едно, така че да могат да бъдат съединени от ДНК лигаза.
Не всички рестриктивни ензими произвеждат лепкави краища. Някои са "тъпи резачи", които срязват право през средата на една целева последователност и не оставят увисване. Рестриктивният ензим SmaI е пример за тъп резач:
Един SmaI ензим се прикрепя към SmaI ограничително място, което е:
5'-...ЦЦЦГГГ...-3' 3'-...ГГГЦЦЦ...5'
Той прави разрез право през средата на тази последователност във двете вериги, произвеждайки тъпи краища. Изрязаните места са:
5'-...ЦЦЦ|ГГГ...-3' 3'-...ГГГ|ЦЦЦ...5'
Фрагментите с тъпи краища също могат да бъдат съединени един към друг от ДНК лигаза. Но фрагментите с тъпи краища са по-трудни за лигиране (свързване) помежду си (реакцията на лигиране е по-неефикасна и е по-вероятно да се провали), понеже няма едноверижни увисвания, които да задържат ДНК молекулите на едно място.

ДНК лигаза

Ако учиш за ДНК репликация, може вече да познаваш ензима ДНК лигаза. При репликацията на ДНК работата на лигазата е да съедини в едно фрагменти от новосинтезирана ДНК, за да образува безупречна нишка. Лигазите, използвани в ДНК клонирането, правят същото нещо. Ако два фрагмента ДНК имат комплементарни краища, ДНК лигазата може да ги свърже в едно, за да направи една молекула.
Фрагмент 1 от ДНК:
5'-...Г 3'-...ЦTTAA
Фрагмент 2 от ДНК:
AATTЦ...-3' Г...-5'
Едноверижните участъци на двете молекули могат да се задържат в едно чрез водородни връзки, но все още ще има прекъсвания в основната верига:
5'-...Г|ААТТЦ...-3' 3'-...ЦТТАА|Г...-5'
ДНК лигазата запълва прекъсванията, за да направи цялостна молекула ДНК:
5'-...ГААТТЦ...-3' 3'-...ЦТТААГ...-5'
Как ДНК лигазата прави това? Като използва АТФ като енергиен източник, лигазата катализира реакция, в която фосфатната група, стърчаща от 5’ края на една ДНК верига се свързва с хидроксилната група, стърчаща от 3’ края на другата. Тази реакция води до получаване на една захаро-фосфатна верига.

Пример: Изграждане на рекомбинантен плазмид

Да видим как рестриктивното срязване и лигирането могат да бъдат използвани за вмъкване на един ген в един плазмид. Предположи, че имаме целеви ген, обграден от места за разпознаване на EcoRI, и един плазмид, съдържащ едно единично EcoRI място:
Започваме с един целеви ген и един кръгов плазмид. Целевият ген има две рестриктивни EcoRI места близо до краищата си. Плазмидът има едно EcoRI място в себе си, което е точно след един промотор, който дава начало на експресията в бактериите. Поредицата на EcoRI местата е:
5'-ГAATTЦ-3' 3'-ЦTTAAГ-5'
Целта ни е да използваме ензима EcoRI, за да вмъкнем гена в плазмида. Първо отделно срязваме фрагмента и плазмида с EcoRI. В тази стъпка се получават фрагменти с лепкави краища:
Поотделно срязваме генния фрагмент и плазмида с EcoRI. Тази стъпка води до получаване на фрагменти с лепкави краища. Всички краища имат увисване от четири нуклеотида с поредицата 5'-AATT-3'. Причината за това е моделът на изрязване на EcoRI:
5'-Г|AATTЦ-3' 3'-ЦTTAA|Г-5'
След това взимаме генния фрагмент и линеаризирания (отворен) плазмид и ги съединяваме с ДНК лигаза. Лепкавите краища на двата фрагмента се залепят един за друг чрез съчетаването на комплементарните бази:
След това взимаме генния фрагмент и линеаризирания (отворен) плазмид и ги съединяваме с ДНК лигаза. Лепкавите краища на двата фрагмента се залепват в едно чрез съчетаване на комплементарните бази. Но все още има прекъсвания в захарно-фосфатните вериги на двойната спирала на ДНК в точките на събиране, където се срещат ДНК на гена и на плазмида.
След като са свързани от лигазата, фрагментите стават една непрекъсната ДНК верига. Целевият ген сега е вмъкнат в плазмида, създавайки рекомбинантен плазмид.
След като са съединени от лигазата, фрагментите стават една непрекъсната ДНК молекула. Целевият ген сега е вмъкнат в плазмида, създавайки рекомбинантен плазмид. В плазмида генът сега е обграден от две EcoRI места, които са се получили, когато изрязаните краища са били лигирани (свързани) заедно.

Рестриктивното срязване и лигирането включват много молекули ДНК

В примера по-горе видяхме един резултат от лигиране между един ген и един плазмид, изрязан с EcoRI. Но в точно същото лигиране може да се получат и други резултати. Например изрязаният плазмид може да се затвори отново (да стане отново кръгов), без да приеме гена. Подобно, генът може да влезе в плазмида, но обърнат наобратно (тъй като двата му EcoRI лепкави края са идентични).
Вляво: рекомбиниран плазмид, произведен, когато генът премине напред ("сочейки" настрани от промотора, който вече е в плазмида).
В средата: нерекомбинантен плазмид, произведен, когато срязаният плазмид просто се затвори (краищата му лигират един с друг).
Вдясно: рекомбинантен плазмид, произведен, когато генът влезе назад ("сочейки" назад към промотора, който вече е в плазмида).
Рестриктивните срязвания и лигирания като това се извършват с използване на много копия на плазмидно и генно ДНК. Всъщност милиарди молекули ДНК се използват в едно единично лигиране! Тези молекули се сблъскват една с друга и с ДНК лигазата на случаен принцип по различи начини. Тоест, ако е възможно получаването на някакъв брой различни продукти, всички те ще бъдат направени в някаква степен – включително тези, които не искаме.
Как можем да избегнем "лошите" плазмиди? Когато трансформираме бактерии с ДНК от едно лигиране, всяка взима различна част ДНК. Можем да проверим бактериите след трансформация и да използваме само тези с правилния плазмид. В много случаи плазмид от трансформираните бактерии се анализира с използването на друго рестриктивно срязване, за да видим дали съдържа правилната ДНК последователност с правилната ориентация.

Разгледай темата извън Кан Академия

Искаш да научиш повече за рестриктивните ензими? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.
Искаш да научиш повече за ДНК лигазата? Виж тази интерактивна анимация и тази симулация от LabXchange.
LabXchange е безплатна, научно-образователна онлайн платформа, създадена от факултета по изкуства и науки на университета Харвард с подкрепата на фондация Amgen.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Все още няма публикации.
Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.