Клониране на ДНК и рекомбинантна ДНК

Да разгледаме клонирането на ДНК. То представлява създаването на идентични копия на даден участък от ДНК. Всъщност това е част от ДНК, която зашифрова нещо, което ни е важно. Това е ген, който кодира синтеза на някакъв протеин, който считаме за важен по някаква причина. Може би си чувал/а термина клониране например при войната на клонингите в "Междузвездни войни" или във връзка с овцата Доли. Там се използва същата идея. Ако клонираш животно или организъм, например овца, тогава създаваш животно, което има точно същия генетичен материал като първото животно. Но когато говорим за клониране на ДНК, става дума за нещо по-просто. Въпреки че, както ще видим, това също е изумително. То е създаване на идентични копия на част от ДНК. И как става това? Да речем, че имаме една ДНК верига. Рисувам я като дълга единична линия, но тя всъщност е двойна спирала. И ще го запиша. Това е двойна нишка. Не искам се затруднявам с рисуването на множество нишки. Всъщност ще нарисувам двете вериги. За да не забравяме. Готово. Това е двойната верига на ДНК. Да кажем, че в този участък от ДНК има ген, който искаме да клонираме. Искаме да направим копия на този участък, на този ген. Ген, който ще клонираме. Първото нещо, което ще направим, е да отрежем този ген по някакъв начин. А това става, като използваме рестрикционни ензими. Има множество рестрикционни ензими. Лично аз го намирам за невероятно, че ние, като цивилизация, сме стигнали до момент, в който можем да идентифицираме тези ензими. Знаем в какви точки от веригата на ДНК те могат да я срежат. Те разпознават определени последователсности. И можем да определим кои рестрикционни ензими трябва да използваме, за да отрежем различни парченца от ДНК. Стигнали сме до тази точка на познание като цивилизация. Така, използваме рестрикционни ензими. Можем да използваме един такъв ензим. Нека ползвам друг цвят. Ензим, който се закача ето тук, разпознава генетичната последователност точно тук и срязва на точното място. Това може да е един рестрикционен ензим ето тук. И после можеш да използваш друг ензим, който разпознава последователността за срязване от другата страна. Нека надпиша това. Тези, тези неща тук са рестрикционни ензими. Рестрикционни ензими. Така че, след като си приложил рестрикционните ензими, ще имаш само този ген. Може би ще имаш малко остатъци от двете страни. Но ще бъде отрязан само този ген. След като си използвал рестрикционните ензими да отделиш гена, ще искаш да го сложиш в т.нар. плазмид. Плазмид е парче генетичен материал, който се намира извън хромозомите, но може да възпроизвежда или с други думи – точно да копира, като използва механизмите, използва генетичната машинария на организма. Може дори да се експресира, точно както гените в организма, които са в хромозомите се експресират. Така, тук режем, нека го запиша, изрязваме гена и после искаме да го сложим в плазмид. Плазмидите обикновено са кръгообразни ДНК вериги. Слагаме го в плазмида. За да могат да се свържат, често тези краища провисват. Можеш да имаш увисване тук и също от другата страна. И плазмидът, който ползваме, може да има комплементарни базови двойки, които припокриват издадените участъци, което позволява по-лесно да си взаимодействат. Ако ги има тези припокривания. Поставяме това в плазмида. И това е невероятно, защото очевидно ДНК не е нещо, което можем да манипулираме с ръцете си, подобно на рязане на нещо и лепене с тиксо. Правиш специални разтвори и прилагаш рестрикционните ензими. Рестрикционните ензими просто режат тези неща, които намират в огромния обем, сблъскват се по точния начин, за да причинят реакция и после взимаш тези гени и ги слагаш в плазмидите, които имат точните последователности на краищата си, така че да си паснат. И после слагаш ДНК-лигаза. ДНК-лигаза, която да свърже веригите ето тук. Споменахме ДНК-лигазата, когато учихме за репликацията. Това е ДНК-лигаза, представи си я като нещо, което помага на слепването. Сега имаме този плазмид и искаме да го вкараме в организъм, който може да произведе негови копия. И организмът, който обикновено се използва, е бактерия, най-често E. coli. И какво можем да направим? Да речем, че имаме една епруветка ето тук. Имаме епруветка, пълна с разтвор с един куп ешерихия коли. Ешерихия коли. Реално няма да можеш да го видиш но E. coli е в този разтвор. И тогава ще сложиш плазмидите си, които ще са още по-трудни за виждане, в този разтвор. И искаме по някакъв начин тези плазмиди да попаднат в клетките на бактериите. Това обикновено става, като се предизвика някакъв шок в системата, който кара бактериите да погълнат плазмида. Типичният шок е топлинен. Все още не е напълно изяснено как точно работи този топлинен шок. Но работи. И хората го използват от доста време насам. Ако имаш бактерия точно тук, и тя има своята ДНК. Това е нейният собствен генетичен материал, ето тук. Нека го надпиша. Това е бактерията. Ако я поставиш в присъствието на нашите плазмиди... Слагаш я при плазмидите и прилагаш топлинния шок. И част от тази бактерия ще поеме плазмида. Ще погълне плазмида по този начин – ще го приеме. Тогава какво следва? После слагаш разтвора с бактериите, част от които са приели плазмидите, слагаш ги в петриева паничка и се опитваш да отгледаш бактериите. Нека нарисувам това тук. Това е петриевата паничка, в която ще отгледаме бактериите. Вътре има хранителна среда, върху която бактериите да растат. Има хранителна среда. И можеш да си кажеш: "Добре, значи слагаме това тук и куп бактерии си се развиват." Ще видиш нещо подобно, много, много, много бактериални клетки, бактериални колонии. Можеш да ги оставиш да си растат. Но има един проблем, защото споменах, че някои от бактериите ще поемат плазмидите, а други няма. И няма да знаеш кога тази бактерия с плазмида ще се възпроизведе и ще формира някоя от тези колонии. Това тук е желаната от теб колония. Това е желаната колония. Слагам тикче тук. Но може би тази колония тук е формирана от първична бактерия или от група бактерии, които не са приели плазмиди. И няма да съдържа гена, който ни трябва. Не искаш тази тук. Как тогава селектираш бактериите, които са приели плазмидите? Освен гена, който те интересува, на който искаш да направиш копия, в плазмида добавяш и ген, който отговаря за антибиотична устойчивост Така, имаш ген за антибиотична устойчивост тук. По този начин само бактериите, които са се свързали с плазмида, ще имат тази устойчивост към антибиотици. И мисля, че е невероятно, че човечеството е способно да прави такива неща. После в хранителната среда слагаш антибиотик. Плюс антибиотик. И тогава тази колония ще оцелее, понеже е устойчива на антибиотици. Има гена, който позволява да не се влияе от антибиотици. А тези няма да оцелеят. Те дори няма да се развият. Няма да се развият, защото хранителните вещества са смесени с антибиотици. И това е много готино нещо. Идентифицирал си гена, който те интересува, изрязал си го и си го залепил върху плазмида – ще ги надпиша – в плазмид, който също съдържа също така и ген, даващ антибиотична резистентност на всяка бактерия, която приеме плазмида. Слагаш тези плазмиди при бактериите или ги подлагаш на някакъв вид шок – може би топлинен шок, така че част от бактериите да приемат плазмида. И после бактериите започват да се размножават. И като се размножават, произвеждат и плазмидите, защото притежават устойчивост към антибиотици. Те ще се развият в тази антибиотично-хранителна среда. А бактериите, които не са се свързали с плазмиди, няма да се развият. И по този начин можеш да вземеш тази колония ето тук, и да я сложиш в друг разтвор или да продължиш да я отглеждаш. И така ще имаш множество копия на гена, които са вътре в тези бактерии. Следващият въпрос, (тук опростявам нещата наистина много) е как използваш тези бактерии, с копия на гена в тях? Да кажем генът е за нещо, което искаш да произведеш, например инсулин за диабет. Всъщност можеш да използваш механизмите на тази бактерия. Използвахме репродуктивните ѝ механизми за копирането на генетичната информация. Но можеш също да използваш производствените ѝ механизми, ако мога да се изразя така, които служат за експресиране на собствената ѝ ДНК, да ги използваш за експресиране на гените, които съдържа плазмида. Всъщност точно това дава на бактерията антибиотична резистентност. Но ако този ген е, да речем, за инсулин, тогава бактерията ще произведе голямо количество инсулин, което можеш да използваш по някакъв начин. Няма да навлизам в детайли как ще извлечеш инсулина от клетките и как можеш да го използваш. Но няма нужда да казвам даже колко готино е, че можем да стигнем дори дотук.