Основно съдържание
ДНК секвениране
Как се определя последователността на нуклеотидните бази (A, T, C и G) в част от ДНК.
Ключови точки:
- ДНК секвениране е процесът на определяне на последователността на нуклеотидите (A, T, Ц и Г) в един фрагмент от ДНК.
- При метода за секвениране на Сангър целевата ДНК се копира много пъти, създавайки фрагменти с различни дължини. Флуоресцентни "прекъсващи веригата" нуклеотиди маркират краищата на фрагментите и позволяват определянето на нуклеотидната последователност.
- Техниките, използвани при секвенирането от ново поколение, представляват нови, широкомащабни подходи, които увеличават скоростта и намаляват разходите за ДНК секвениране.
Какво е секвениране?
Може би чуваш за секвениране на геноми. Например секвенирането на човешкия геном е бил завършено през 2003 г. след многогодишни международни усилия. Но какво означава секвениране на геном или дори на малък фрагмент ДНК?
ДНК секвениране е процесът на определяне на последователността на нуклеотидните бази (А, Т, Ц и Г) в един ДНК фрагмент. Днес с правилната екипировка и материали секвенирането на къс фрагмент ДНК е сравнително лесно.
Секвенирането на цял геном (цялата ДНК на един организъм) остава сложна задача. Изисква разделянето на ДНК на генома на много малки части, секвениране на частите и събиране на поредиците в един единствен дълъг "консенсус." Но благодарение на нови методи, които са били развити през последните две десетилетия, секвенирането на генома сега е много по-бързо и по-евтино, отколкото е било при Проекта за човешкия геном
В тази статия ще разгледаме методите, използвани за ДНК секвениране. Ще се фокусираме върху един установен метод, секвениране на Сангър, но също ще обсъдим новите ("следващо поколение") методи, които са намалили разходите и са увеличили скоростта на широкомащабното секвениране.
Секвениране на Сангър: Методът с прекъсване на веригата
Участъци ДНК с дължина до около
В Проекта за човешкия геном секвенирането на Сангър е било използвано за определяне на нуклеотидната последователност на голям брой сравнително къси фрагменти от човешкото ДНК. (Тези фрагменти не са били задължително с дължина
Въпреки че геномите сега обикновено се секвенират с използването на други методи, които са по-бързи и по-евтини, секвенирането на Сангър все още се употребява широко за секвенирането на индивидуални части ДНК, например фрагменти, използвани в ДНК клониране или генерирани чрез полимеразна верижна реакция (PCR).
Съставки за секвениране на Сангър
Секвенирането на Сангър включва създаване на много копия от един целеви ДНК участък. Съставките, използвани в него, са подобни на тези, които са нужни за ДНК репликация в един организъм, или за полимеразна верижна реакция (PCR), която копира ДНК ин витро. Те включват:
- Ензим ДНК полимераза
- Праймер, което е късо парче едноверижна ДНК, която се прикрепя към ДНК матрицата и действа като "стартер" за полимеразата
- Четири ДНК нуклеотиди (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
- ДНК матрица, която ще се секвенира
Но реакцията за секвениране на Сангър съдържа и една уникална съставка:
- Дидеокси версии или прекъсващи веригата версии на всички четири нуклеотида (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), всеки отбелязан с различен цвят боя
Дидеокси нуклеотидите са подобни на нормалните, или деокси, нуклеотидите, но с една ключова разлика: липсва им хидроксилна група на 3’ въглерода на захарния пръстен. В един нормален нуклеотид 3’ хидроксилната група действа като "кука", позволявайки на нов нуклеотид да бъде добавен към една съществуваща верига.
След като един дидеокси нуклеотид бъде добавен към веригата, тъй като той няма налична хидроксилна група, не могат да бъдат добавени повече нуклеотиди. Веригата приключва с дидеокси нуклеотида, който е отбелязан със специфичен цвят боя, в зависимост от базата (А, Т, Ц или Г), която носи.
Метод на секвениране на Сангер
ДНК пробата, която ще бъде секвенирана, се смесва в епруветка с праймер, ДНК полимераза и ДНК нуклеотиди (dATP, dTTP, dGTP и dCTP). Четирите отбелязани с оцветяване, прекъсващи веригата дидеокси нуклеотиди, се добавят в много по-малки количества от обикновените нуклеотиди.
Сместа първо се загрява, за да се денатурира ДНК матрицата (да се разделят нишките), а после се охлажда, така че праймерът да може да се прикрепи към едноверижна матрица. След като праймерът се прикрепи, температурата отново се повишава, което позволява на ДНК полимеразата да синтезира нова ДНК, започвайки от праймера. ДНК полимеразата продължава да добавя нуклеотиди към веригата, докато не добави един дидеокси нуклеотид вместо нормален такъв. В този момент вече не могат да се добавят повече нуклеотиди, така че веригата свършва с дидеокси нуклеотида.
Този процес се повтаря в няколко цикъла. Докато циклирането приключи, буквално е гарантирано, че един дидеокси нуклеотид е добавен във всяка една позиция на целевата ДНК при поне една реакция. Тоест епруветката ще съдържа фрагменти с различни дължини, които прекъсват при всяка от нуклеотидните позиции в оригиналното ДНК (виж фигурата по-долу). Краищата на фрагментите ще бъдат отбелязани с оцветявания, които посочват крайния им нуклеотид.
След като реакцията приключи, фрагментите се пропускат през дълга, тънка тръбичка, съдържаща гел матрица, в процес, наречен капилярна гел електрофореза. Късите фрагменти преминават бързо през порите на гела, докато дългите фрагменти преминават по-бавно. Когато всеки фрагмент преминава през "финалната линия" в края на тръбичката, тя се осветява от лазер, при което се засича прикрепеният оцветител.
Най-малкият фрагмент (приключващ точно един нуклеотид след праймера) пресича първи финалната линия, следван от следващия най-малък фрагмент (свършващ два нуклеотида след праймера) и така нататък. Следователно от цветовете на оцветяването, регистрирани един след друг от детектора, последователността на оригиналния участък ДНК може да бъде намерена нуклеотид по нуклеотид. Данните, записани от детектора, представляват серии върхове на флуоресцентния интензитет, както е показано на хроматограмата по-горе. ДНК последователността се установява от върховете в хроматограмата.
Употреби и ограничения
С метода за секвениране на Сангер може да се установи висококачествено последователността на сравнително дълги участъци ДНК (до около
Но секвенирането на Сангер е скъпо и неефективно за широкомащабни проекти като секвениране на целия геном или метагеном ("колективния геном" на една микробна общност). За подобни задачи се използват нови широкомащабни техники на секвениране, които са по-бързи и по-евтини.
Секвениране от ново поколение
Името може да звучи малко като Стар Трек, но наистина така се казва! Най-скорошните технологии за ДНК секвениране събирателно се наричат секвениране от ново поколение.
Има множество техники от новата генерация секвениране, които използват различни технологии. Но повечето споделят общ набор характеристики, които ги различават от секвенирането на Сангер:
- Висока паралелност: едновременно се провеждат много реакции на секвениране
- Микро мащаб: реакциите са малки и много от тях могат да бъдат направени наведнъж на един чип
- Бързи: понеже реакциите се извършват успоредно, резултатите стават готови много по-бързо
- Евтини: секвенирането на един геном е по-евтино, отколкото със секвениране на Сангер
- По-малка дължина: обикновено се работи с дължини в диапазона около
Концептуално, секвенирането от ново поколение е като паралелно провеждане на много голям брой малки реакции на секвениране на Сангер. Благодарение на това и на малкия мащаб, големи количества ДНК могат да бъдат секвенирани много по-бързо и евтино с методите от ново поколение, отколкото със секвениране на Сангер. Например през 2001 г. цената на секвенирането на човешки геном е била почти
Защо е важно бързото и евтино секвениране? Способността за рутинно секвениране на геноми отваря нови възможности за биологично проучване и биомедицински приложения. Например евтиното секвениране е стъпка към персонализираната медицина – тоест, настройване на медицинското лечение към нуждите на отделния човек въз основа на генетичните вариации на неговия или нейния геном.
Искаш ли да се присъединиш към разговора?
Все още няма публикации.