If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Ако си зад уеб филтър, моля, увери се, че домейните *. kastatic.org и *. kasandbox.org са разрешени.

Основно съдържание

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Техника, използвана да се разпространи, или да се направят много копия на, специфична целева област от ДНК.

Ключови точки:

  • Полимеразна верижна реакция, или ПВР (PCR), е техника за създаване на много копия на един специфичен ДНК участък ин витро (в епруветка, а не в организъм).
  • PCR разчита на термостабилна (температурно стабилна) ДНК полимераза, Taq полимераза, и се нуждае от ДНК праймери, специално създадени за интересуващия ни ДНК регион.
  • В метода PCR реакцията преминава през серия цикли с температурни промени, което позволява да бъдат създадени много копия на целевия регион.
  • Методът PCR има много изследователски и практически приложения.Използва се рутинно при клониране на ДНК, в медицинската диагностика и съдебномедицинския анализ на ДНК.

Какво е PCR(ПВР)?

Полимеразната верижна реакция (PCR(ПВР)) е често използвана лабораторна техника за създаване на много копия (милиони или милиарди!) от един специфичен ДНК участък. Този ДНК участък може да е всеки участък, който интересува изследователя. Например може да е ген, чиято функция изследователят иска да разбере, или генетичен маркер, използван от криминолозите, за да се съпостави ДНК от местопрестъпление със заподозрените.
Обикновено целта на PCR е да се направят достатъчно копия от целевия ДНК участък, така че да могат да бъдат анализирани или използвани по друг начин. Например ДНК, увеличено от PCR, може да бъде изпратено за секвениране, визуализирано с гел електрофореза, или клонирано в плазмид за последващи експерименти.
PCR се използва в много области на биологията и медицината, включително молекулярно биологични проучвания, медицинска диагностика и дори някои клонове на екологията.

Taq полимераза

Както ДНК репликацията в един организъм, PCR изисква ензима ДНК полимераза, който създава нови нишки ДНК, използвайки съществуващи нишки за модел. ДНК полимеразата, която обикновено се използва в PCR, се нарича Taq полимераза, наречена на издържащата на топлина бактерия, от която е била изолирана (Thermus aquaticus).
T. aquaticus живее в горещи извори и хидротермални находища. Неговата ДНК полимераза се отличава с голяма термична стабилност и е най-активна около 70°C (температура, при която човешката ДНК полимераза или такава на E. coli няма да са ефективни). Тази топлинна стабилност прави Taq полимеразата идеална за PCR метода. Както ще видим, висока температура се използва няколко пъти при PCR, за да денатурира ДНК матрицата, или за да раздели нишките ѝ.

PCR праймери

Както другите ДНК полимерази, Taq полимеразата може да създаде ДНК, само ако ѝ бъде даден праймер, кратка последователност от нуклеотиди, които предоставят начална точка за ДНК синтез. В реакция на PCR изследователят определя региона ДНК, който ще бъде копиран, или увеличен, чрез праймерите, които той или тя избира.
PCR праймерите са кратки участъци едноверижна ДНК, обикновено с дължина около 20 нуклеотида. Два праймера се използват във всяка реакция на PCR и те са създадени така, че да оградят целевия участък от ДНК (който трябва да бъде копиран). Тоест имат такива последователности, чрез които ще могат да се прикрепят към противоположните вериги на ДНК модела, точно в краищата на участъка, който ще се копира. Праймерите се прикрепят към матрицата чрез съчетаване на комплементарните бази.
Шаблонна ДНК:
5' TATЦAГATЦЦATГГAГT...ГAГTAЦTAГTЦЦTATГAГT 3' 3' ATAГTЦTAГГTAЦЦTЦA...ЦTЦATГATЦAГГATAЦTЦA 5'
Праймер 1: 5' ЦAГATЦЦATГГ 3' Праймер 2:
Когато праймерите са свързани със шаблона, те могат да бъдат удължени чрез полимеразата и участъкът, който лежи между тях, ще бъде копиран.

Стъпките на PCR

Ключовите съставки за една PCR реакция са Taq полимераза, праймери, шаблонна ДНК и нуклеотиди (градивни единици на ДНК). Съставките биват събрани в една епруветка, заедно с кофактори, които са необходими на ензима, и преминават през повтарящи се цикли на затопляне и охлаждане, които позволяват синтезирането на ДНК.
Основните стъпки са:
  1. Денатурация (96°C): Реакционната смес се загрява силно, за да се отделят или денатурират ДНК веригите. Така се получава едноверижна матрица за следващата стъпка.
  2. Отгряване (55 - 65°C): Реакционната смес се охлажда, така че праймерите да могат да се прикрепят към комплементарните си поредици на едноверижната матрица ДНК.
  3. Удължаване (72°C): Температурата се повишава, така че Taq полимеразата да удължи праймерите, синтезирайки нови вериги ДНК.
Този цикъл се повтаря 25 - 35 пъти в една типична PCR реакция, което обикновено отнема 2 - 4 часа в зависимост от дължината на копирания ДНК участък. Ако реакцията е ефикасна (работи добре), целевият участък може да премине от само едно или няколко копия към милиарди.
Причината е, че не само оригиналната ДНК се използва като шаблон всеки път. Вместо това новата ДНК, която е получена в един цикъл, може да служи като шаблон в следващия цикъл на ДНК синтез. Има много копия праймери и много молекули Taq полимераза в реакцията, така че броят ДНК молекули може приблизително да се удвои във всеки цикъл. Този модел на експоненциален растеж е показан на изображението по-долу.

Използване на гел електрофореза за визуализиране на резултатите от PCR

Резултатите от една PCR реакция обикновено се визуализират (стават видими) чрез използване на гел електрофореза. Гел електрофореза е техника, в която фрагментите на ДНК се пропускат през една гел матрица под въздействието на електричен ток и това разделя ДНК фрагментите по размер. Използва се стандарт, или ДНК стълба, за да може да се определи размерът на фрагментите в PCR пробата.
ДНК фрагменти с еднаква дължина образуват "ивица" върху гела, която може да бъде видяна с невъоръжено око, ако гелът е оцветен с пигмент, свързващ се с ДНК. Например фрагмент от PCR реакция, произвеждаща 400 двойки бази (bp), ще изглежда ето така върху гела:
Лява страна: ДНК стълба със 100, 200, 300, 400, 500 bp ивици.
Дясна страна: резултат от PRC реакция, ивица при 400 bp.
Една ДНК ивица съдържа много, много копия от целевия ДНК участък, не само едно или няколко копия. Понеже ДНК е микроскопична, трябва да има много копия от нея, за да можем да я видим с невъоръжено око. Това е една от причините PCR да е толкова важен инструмент: произвежда достатъчно копия от една ДНК последователност, че да можем да видим или да манипулираме този участък от ДНК.

Приложения на PCR

При използването на PCR една ДНК последователност може да бъде увеличена милиони или милиарди пъти, произвеждайки достатъчно ДНК копия, които да могат да бъдат анализирани с използването на други техники. Например ДНК може да бъде визуализирана с гел електрофореза, изпратена за секвениране или срязана с рестриктивни ензими и клонирана в плазмид.
Методът PCR се използва в много изследователски лаборатории и също има практически приложения в криминалистиката, генетичните изследвания и диагностиката. Например PCR се използва за увеличаване на гени, свързани с генетични разстройства, от ДНК на пациенти (или от ДНК на фетуса в случай на пренатално изследване). PCR може да се използва за установяване на наличието на бактерия или ДНК вирус в тялото на пациента: ако е наличен патоген, могат да се увеличат участъци от неговата ДНК от кръвна или тъканна проба.

Примерна задача: PCR в криминалистиката

Предположи, че работиш в криминалогична лаборатория. Току-що получи ДНК проба от косъм, останал на местопрестъплението, заедно с ДНК проби от трима възможни заподозрени. Работата ти е да проучиш един специфичен генетичен маркер и да видиш дали ДНК-то на някой от тримата заподозрени съвпада с ДНК-то от косъма за този маркер.
Маркерът има два алела, или версии. Единият съдържа единично повторение (кафявият регион по-долу), докато другият съдържа две копия от повторението. В една PCR реакция с праймери, които ограждат повторения регион, първият алел произвежда 200 bp ДНК фрагмент, докато вторият произвежда 300 bp ДНК фрагмент:
Маркерен алел 1: праймери, ограждащи повтарящия се регион, увеличават 200 bp фрагмент ДНК
Маркерен алел 2: праймери, ограждащи повтарящия се регион, увеличават 300 bp фрагмент ДНК
Извършваш PCR на четири ДНК проби и визуализираш резултатите чрез гел електрофореза, както е показано по-долу:
Гелът има пет ленти:
Първа лента: ДНК стълба със 100, 200, 300, 400 и 500 bp ивици.
Втора лента: ДНК от местопрестъплението, 200 bp ивица.
Трета лента: ДНК на заподозрян #1, 300 bp ивица.
Четвърта лента: ДНК на заподозрян #2, 200 и 300 bp ивици.
Пета лента: ДНК на заподозрян #3, 200 bp ивица.
ДНК на кой заподозрян съответства на ДНК-то от местопрестъплението по този маркер?
Избери един отговор:

Още за PCR и криминалистиката

В реалните криминалологични тестове на ДНК от местопрестъпление техниците ще направят анализ, подобен на този в примера по-горе. Но ще бъдат сравнени няколко различни маркери (не само единственият маркер в примера) между ДНК от местопрестъплението и ДНК на заподозрения.
Също така, маркерите, използвани в един типичен съдебномедицински анализ, обикновено не са само в две различни форми. Вместо това те са силно полиморфни (поли = много, морфни = форма). Тоест идват в много алели, които се различават по малки разлики на дължината.
Най-често използваният вид маркери в криминологията, наречени кратки тандемни повторения (STRs), се състоят от много повтарящи се копия от една и съща кратка нуклеотидна последователност (обикновено с дължина 2 до 5 нуклеотида). Един алел на STR може да има 20 повторения, докато друг може да има 18, а друг – само 101.
Като изследват множество маркери, всеки от които има много алелни форми, криминолозите могат да изградят уникален генетичен "отпечатък" от една ДНК проба. В един типичен STR анализ с използване на 13 маркера, шансовете за фалшиво положителен резултат (двама души да имат еднакъв ДНК "отпечатък") са по-малки от 1 на 10 милиарда1!
Въпреки че обикновено приемаме ДНК доказателствата като средство за осъждане на престъпници, то често са имали жизненоважна роля при оправдаването на погрешно обвинени хора (някои от които са били в затвор много години). Криминологичният анализ също се използва за установяване на бащинство и идентифициране на човешки останки при бедствия.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Все още няма публикации.
Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.