Зареждане

Полимеразна верижна реакция (PCR)

Видео транскрипция

Тук съм с Емили, нашият сътрудник по биологични въпроси, за да говорим за полимеразната верижна реакция (PCR). Всъщност си я провеждала доста пъти. Защо си провежала много PCR? – PCR беше нещо като основата на дипломната ми работа, в която строих всякакви видове рекомбинантни ДНК молекули. и ги използвах, за да науча неща за растенията. –И какво прави PCR в частност? – PCR по същество ти създава много копия на определен фрагмент от ДНК, който те интересува. – И как ... Защо биха ти трябвали много копия на определен сегмент от ДНК? – Можеш да искаш да правиш много копия, за да можеш да ги клонираш в плазмиди И после да правиш други опити с тях. Това е голямата полза. – И като говорим за клониране, става дума за поставяне на фрагмент от ДНК вътре в плазмид. Не е като просто да сложиш един фрагмент в един плазмид – ще го направиш с много, така че имаш нужда от много фрагменти ДНК. – Точно. Точно така. – И можеш да започнеш с много малка проба ДНК. Къде другаде би могла да правиш PCR? – PCR се използва често в съдебната медицина, също при медицинска диагностика. Това може да е твоето ДНК което се проверява дали имаш ген, който предразполага да имаш определено здравословен проблем. Има всякакви видове практически приложения. –Защото е трудно да разпознаеш само един фрагмент от този ген. Затова искаш да направиш копия или както се казва – да направиш амплификация, така че да можеш да го прекараш през гелове и други неща и да видиш колко са големи тези молекули и пр. –Точно. Ако гледаш просто ДНК-то, извадено от клетката ти, това ще е игла в купа сено. Но по този начин можеш наистина да увеличиш мащаба и да разглеждаш точно нещото, което ти тябва. –Добре. Тук си нарисувала няколко диаграми. Всъщност аз никога не съм правил RCR, но ти си. Така че ще ти кажа как си го представям аз, че се случва. И после ти ще ми кажеш дали е така. Тази рисунка тук е двойната верига на ДНК. И това може да е от косъм на нечия коса, например. Или нещо друго. И да речем, че искаме да копираме или да направим много, много копия на фрагмент от това. Да речем, че се интересуваме от ето този участък – от тук до... тук. Искаме да направим множество копия на ето тази част . И това е първата стъпка: денатурация. Трудно ми е да произнасям някои думи. –Странна дума е. –Странна е, да. Имаш 96 градуса по Целзий, това е почти точката на кипене. Доста горещо значи. И това разделя двете вериги. –Абсолютно вярно. –И щом те са разделени, тогава можеш да охладиш малко нещата, въпреки че все още не са съвсем студени. На 55 градуса по Целзий би било доста некомфортно. Но ще ги охладиш до тази температура и после тези праймери се появяват. Да си припомним едно нещо – този процес се случва във епруветка или в голям разтвор. Значи загряваш го, двете нишки на ДНК се разделят... А дали този праймер просто си седи наоколо? –Праймерът е нещо, което си поръчал от някоя компания, и си поръчал голямо количество. И слагаш много праймер в твоята реакция, за да има добър шанс, когато стигнеш до стъпката, която наричаме хибридизация, този праймер да се свърже с голяма част от твоите парченца ДНК. –Значи, ако това е нашият разтвор, това всичко във вода ли се случва? –Вода с някакви соли и други неща, да. –Добре. Имаме нашия разтвор ето тук. Ще сложиш първоначалните проби ДНК в него, което, отново, е много малко количество. И ще сложиш много праймер. Ще искаш да го имаш в излизшък. Нека оцветя това в цикламено. Очевидно няма да се вижда в реалния живот. Просто всичко ще се разтвори. –Ще изглежда просто като капка течност. –Ще изглежда... ...но за да го онагледим. Слагаш много праймер и го нагряваш, ДНК нишките се разделят и после като го охладиш... Този праймер ще е специфичен за краищата на участъка, който искаш да копираш. –Точно така. –Когато поръчваш онлайн или някъде другаде определен праймер, ще избереш последователността на този праймер да отговаря на участъците, които искаш да копраш. –Именно. Това е супер важно. –Добре. Значи като го охладиш, праймерът се закрепя и после го нагряваш отново, не чак до 96 градуса, но до 72 градуса по Целзий. И тогава удължаваш тези. И допускам, че – понеже се казва полимеразна верижна реакция – тук е мястото, където полимеразата влиза в действие. –Точно тук идва полимеразата. –Значи полимеразата е това, което реално удължава това. Просто ще нарисувам ензима полимераза ето тук, който извършва удължаването. И който и да е тип полимераза ли е това? Мога ли да взема полимеразата от клетките си и да я пусна тук? –Всъщност имаш нужда от специална полимераза, защото ти трябва такава, която е доста термоустойчива. Както спомена, дори стъпката с охлаждането в този процес, не е нещо, в което тялото ти ще иска да вземе участие. Та полимеразата е реално от наистина термоустойчиви микроорганизми. – И какви са те? Казва се taq-полимераза, нали? –Мисля, че е thermophilus aquaticus. Сложна дума. –Открили са я върху горещи земни пукнатини. Тези организми могат да издържат на тези високи температури. Но това води до друг въпрос: защо изобщо трябва да го нагряваш? Предполагам, за да разделиш двете вериги? –Това наистина е основната причина. Тряба да ги разделиш, нямаш ензим, който да го стори, както се случва в клетка, така че топлината върши добра работа. –Добре, разбирам. Значи това е една стъпка. Разбирам поне частта за полимеразата от PCR. Където го нагряваш, веригите се разделят, имаш всичкия излишен праймер тук. И понеже има толкова много праймер, е много по-вероятно той да се свърже с тази част от секвенцията. След това за да могат тези две нишки да се съберат отново имаш полимеразата. По-точно taq-полимераза. И това ще си го сложил още отначало, taq-полимеразата. Ще я сложа в жълто. Ще сложиш всичката тази taq-полимераза тук вътре. И още веднъж: тези неща не са роботи. Те не знаят какво точно трябва да направят. Просто се блъскат в разни неща по правилния начин и реагират по правилния начин. И после ще трябва да добавиш един куп нуклеотиди. –Да, точно така. Твоята реакция няма да сработи, ако забравиш нуклеотидите. –Значи като загрееш отново taq-полимеразата след като праймерите са се залепили, тя ще започне да добавя всичките тези нукеотиди. И после просто чакаш определено време? Ще продължи ли да се случва до безкрай? –Ще продължи за известно време. Обикновено избираш колко дълго ще продъжи тази стъпка, така че да съответства на точното време, което ще отнеме на полимеразата да завърши фрагмента. Но ще спре. Или ще утихне, или ще спре, когато отидеш към следващата стъпка. –Добре, разбирам го дотук. До този момент имаме след един цикъл, (тук си написала) след един цикъл ще сме удвоили поне тази част от последователността, която ни вълнува. Въпреки че може и да сме копирали отвъд нея. И къде идва тази верижна реакция? – Можеш да интерпретираш верижната реакция по два начина. Първият е нещо подобно на това, което прави полимеразата - да добави неща, за да построи верига. Но има нещо повече от верижна реакция, което трябва да споменем. И това се получава реално. Случва се тази геометрична прогресия. –Значи минаваш през един цикъл, стигаш до тази ситуация тук. Загряваш го, веригите се разделят, охлаждаш го, праймерите се закрепят, отново го загряваш, taq-полимеразата си върши работата и като всички полимерази, върви в посока от 5' към 3' прим. Говорихме за това при апликацията. –Именно. –И сега имаш две вериги, но след като всичко това е в този разтвор, можеш да го загрееш отново. И тогава тези две вериги могат да се превърнат в... Или тези две могат сега да се преобразуват в четири нишки. После отново охлажадаш. Праймерите се закачат за тях. И все още са същите праймери, защото все още ни вълнува същата последователност. Стигаш от две до четири. И продължаваш да повтаряш това. Колко пъти е типично да повтаряш този цикъл? – 35 може би е обичаен брой цикли. Зависи какво правиш точно. Но ще го правиш доста пъти. –Значи ако го повториш 35 пъти, имам предвид всеки път умножаваш по 2. Това ще бъде 2 на 35 степен. което е над милиард пъти. Колко дълго ще отнеме това? Правила си го преди. –Зависи от дължината на фрагмента, но обикновено към 2-3 часа. –Значи за 2 до 3 часа можеш да стартираш с един фрагмент и да стигнеш до милиарди. –Ако е идеално ефективно – иска ми севинаги да е така. Но обикновено получаваш доста парченца. –И едно нещо, за което винаги съм се чудел, откакто разбрах за първи път за това. Бих искал да вляза в лаборатория и да го направим заедно. Чудил съм се – добре, имаш твоя праймер и после полимеразата ще го удължи по този начин но съм си мислел: знае ли кога трябва да спре? И ти обясни, че при първото минаване може да не знае къде да спре, но когато започнеш да вървиш в другата посока, ето тук, като върви в другата посока, ще стигне край. Няма да има какво да копира повече. –Точно така. –И повече от милиардите молекули, които произвждаш ще бъдат с чисто изрязани краища. –Голямата част от тях - да, точно. –Изумително.