If you're seeing this message, it means we're having trouble loading external resources on our website.

Ако си зад уеб филтър, моля, увери се, че домейните *. kastatic.org и *. kasandbox.org са разрешени.

Основно съдържание
Текущ час:0:00Обща продължителност:9:54

Видео транскрипция

Тук съм с Емили, нашият сътрудник в областта на биологията, за да говорим за полимеразната верижна реакция (PCR). Всъщност си я провеждала доста пъти. Защо си провежала много PCR? – PCR беше нещо като основата на дипломната ми работа, в която строих всякакви видове рекомбинантни ДНК молекули. и ги използвах, за да науча различни неща за растенията. –И какво прави PCR в частност? – PCR по същество създава много копия на определен фрагмент от ДНК, който те интересува. – И как ... Защо биха ти трябвали много копия на определен сегмент от ДНК? – Можеш да искаш да правиш много копия, за да можеш да ги клонираш в плазмиди и после да правиш други опити с тях. Това е голямата полза. – И като говорим за клониране, става дума за поставяне на фрагмент от ДНК вътре в плазмид. Не е като просто да сложиш един фрагмент в един плазмид – ще го направиш с много, така че имаш нужда от много фрагменти ДНК. – Точно. Точно така. – И можеш да започнеш с много малка проба ДНК. Къде другаде би могло да се използва PCR? – PCR се използва често в съдебната медицина, също при медицинска диагностика. Например твоето ДНК би могло да се изследва за наличие на ген, който предразполага към някакъв здравословен проблем. Има всякакви видове практически приложения. –Защото е трудно да откриеш един единствен фрагмент от този ген. Затова искаш да направиш копия или един вид да "усилиш сигнала", така че да можеш да го прекараш през гелове и други неща и да видиш колко са големи тези молекули и пр. –Точно. Ако гледаш просто ДНК-то, взето от клетката ти, това ще е игла в купа сено. Но по този начин можеш наистина да увеличиш мащаба и да разглеждаш точно нещото, което ти трябва. –Добре. Тук си нарисувала няколко диаграми. Всъщност аз никога не съм правил RCR, но ти си. Така че ще ти кажа как аз си представям че се случва, а после ти ще ми кажеш дали е така. Тази рисунка тук е двойната верига на ДНК. Може да е от косъм от нечия коса, например, или от нещо друго. Да кажем, че искаме да копираме или да направим много, много копия на фрагмент от това. Да речем, че се интересуваме от ето този участък – от тук до тук... Искаме да направим множество копия на ето тази част . Първата стъпка е денатурация. Трудно ми е да произнасям някои думи. –Странна дума е. –Странна е, да. При температура 96 градуса по Целзий, това е почти точката на кипене на водата. Доста горещо значи. И това разделя двете вериги. –Абсолютно вярно. –И щом те са разделени, тогава можеш да охладиш малко нещата, не все още не са съвсем студени. При 55 градуса по Целзий би било доста некомфортно. Охлаждаш ги до тази температура и се появяват тези праймери. Да си припомним едно нещо – този процес се случва в епруветка или в голямо количество разтвор. Значи загряваш го, двете нишки на ДНК се разделят... А дали този праймер просто си седи наоколо? –Праймерът е нещо, което си поръчал от някоя компания, и си поръчал голямо количество. Слагаш голямо количество праймер в реакционната си смес, за да има добър шанс, когато стигнеш до стъпката, която наричаме хибридизация, този праймер да се свърже с голяма част от твоите фрагменти ДНК. –Значи, ако това е нашият разтвор, това всичко във вода ли се случва? –Вода с някакви соли и други неща, да. –Добре. Имаме нашия разтвор ето тук. Ще сложиш първоначалните проби ДНК в него, което, повтарям, е много малко количество. И ще сложиш много праймер. Ще искаш да имаш излишък от него. Нека оцветя това в цикламено. Очевидно това не изглежда така в реалността. Просто всичко ще се разтвори. –Ще изглежда просто като капка течност. –Ще изглежда... ...но за да го онагледим... Слагаш много праймер и го нагряваш, ДНК нишките се разделят и после като го охладиш... Този праймер ще е специфичен за краищата на участъка, който искаш да копираш. –Точно така. –Когато поръчваш онлайн или другаде определен праймер, избираш последователността на този праймер да съответства на участъците, които искаш да копираш. –Именно. Това е супер важно. –Добре. Значи като охладиш разтвора, праймерът се закрепя и после го нагряваш отново, не чак до 96 градуса, но до 72 градуса по Целзий. И тогава удължаваш тези. И допускам, че – понеже се казва полимеразна верижна реакция – тук е мястото, където полимеразата влиза в действие. –Точно тук идва полимеразата. –Значи полимеразата е това, което реално удължава това. Просто ще нарисувам ензима полимераза ето тук, който извършва удължаването. И който и да е тип полимераза ли е това? Мога ли да взема полимеразата от клетките си и да я пусна тук? –Всъщност е нужна специална полимераза, която е доста термоустойчива. Както спомена, дори стъпката с охлаждането в този процес, не е нещо, което се случва в твоето тялото Така че тази полимераза реално е от много термоустойчиви микроорганизми. – И какви са те? Казва се taq-полимераза, нали? –Мисля, че е thermophilus aquaticus. Сложна дума. –Открити са върху горещи земни пукнатини. Тези организми могат да издържат на тези високи температури. Но това води до друг въпрос: защо изобщо трябва да се нагрява? Предполагам, за да разделиш двете вериги? –Това наистина е основната причина. Тряба да ги разделиш, нямаш ензим, който да го стори, както се случва в клетка, така че топлината върши добра работа. –Добре, разбирам. Значи това е една стъпка. Разбирам поне частта с полимеразата от наименованието PCR. При нагряване веригите се разделят, имаш цялото това количество праймер в излишък. И понеже има толкова много праймер, е много по-вероятно той да се свърже с тази част от секвенцията. След това, за да могат тези две нишки да се съберат отново, тук имаме полимеразата. По-точно taq-полимераза. Тя е в разтвора още отначало – тази taq-полимераза. Ще я сложа в жълто. Добавяш тази taq-полимераза вътре. И още веднъж: тези неща не са роботи. Те не знаят какво точно трябва да направят. Но когато се сблъскат с разни неща по правилния начин, те реагират по правилния начин. И после ще трябва да добавиш един куп нуклеотиди. –Да, точно така. Твоята реакция няма да сработи, ако забравиш нуклеотидите. –Значи като загрееш отново, taq-полимеразата – след като праймерите са се прикрепили, тя ще започне да добавя всичките тези нукеотиди. И после просто чакаш определено време? Ще продължи ли да се случва до безкрай? –Ще продължи за известно време. Обикновено избираш колко дълго ще продължи тази стъпка, така че да съответства на точното време, което е нужно на полимеразата да завърши фрагмента. Но ще спре. Или ще утихне, или ще спре, когато отидеш към следващата стъпка. –Добре, разбирам го дотук. До този момент имаме след един цикъл, (тук си написала) след един цикъл ще сме удвоили поне тази част от последователността, която ни интересува. Въпреки че може и да сме копирали отвъд нея. Защо се нарича верижна реакция? – Можеш да интерпретираш верижната реакция по два начина. Първият е нещо подобно на това, което прави полимеразата – да добавя неща, за да синтезира верига. Но има нещо повече от верижна реакция, което трябва да споменем, и това е, че реално се получава един вид геометрична прогресия. –Значи минаваш през един цикъл, стигаш до тази ситуация тук. Загряваш го, веригите се разделят, охлаждаш го, праймерите се закрепят, отново го загряваш, taq-полимеразата си върши работата, и като всички полимерази, върви в посока от 5' към 3' прим. Говорихме за това при репликацията. –Именно. –И сега имаш две вериги, но след като всичко това е в този разтвор, можеш да го загрееш отново. И тогава тези две вериги могат да се превърнат в... Или тези две влойни спирали могат сега да станат четири нишки. После отново охлаждаш. Праймерите се закачат за тях. И все още са същите праймери, защото все още ни вълнува същата последователност. Стигаш от едно до две, после до четири. И продължаваш да повтаряш това. Колко пъти е типично да повтаряш този цикъл? – 35 може би е обичаен брой цикли. Зависи какво правиш точно. Но ще го правиш доста пъти. –Значи ако го повториш 35 пъти, всеки път бройката се удвоява. Това е равно на 2 на 35-а степен. което е над милиард пъти. Колко дълго ще отнеме това? Правила си го преди. –Зависи от дължината на фрагмента, но обикновено към 2-3 часа. –Значи за 2 до 3 часа след като в началото имаш един фрагмент стигнеш до милиарди. –Ако е идеално ефективно – иска ми се винаги да е така – но обикновено получаваш доста парченца. –И едно нещо, за което винаги съм се чудел, откакто разбрах за първи път за това. Бих искал да вляза в лаборатория и да го направим заедно. Чудил съм се – добре, имаш твоя праймер и после полимеразата ще го удължи по този начин но съм си мислел: знае ли кога трябва да спре? И ти обясни, че при първото минаване може да не знае къде да спре, но когато започнеш да вървиш в другата посока, ето тук, като върви в другата посока, ще стигне край. Няма да има какво да копира повече. –Точно така. –И тези над милиард молекули, които произвеждаш, ще бъдат с чисто изрязани краища. –Голямата част от тях - да, точно. –Изумително.
Съдържанието по Биология достига до теб с подкрепата на Фондация Амген