Основно съдържание

Курс: Биологична библиотека > Раздел 17

Урок 3: Репликация на ДНК

Модел на ДНК репликация: експеримент на Меселсън-Стал

Класна стая на Google

Ключов исторически експеримент, който показва полу-консервативния механизъм на ДНК репликацията.

Ключови точки:

Има три модела за репликиране на ДНК: полуконсервативен, консервативен и дисперсивен (разсеян).
Според полуконсервативния модел всяка верига ДНК в двойната спирала служи като шаблон за синтеза на нова, комплементарна верига. Този модел изглежда най-вероятен от гледна точка структурата на ДНК.
Моделите били тествани от Меселсън и Стал, които маркирали ДНК на няколко поколения бактерии, като използвали изотопи на азота.
Въз основа на разположението на ДНК маркерите, които наблюдавали, Меселсън и Стал потвърдили, че ДНК се репликира полуконсервативно.

Начин на ДНК репликация

Представи си се през 1953 г., когато току-що е открито, че ДНК има структура на двойна спирала

^{1}

. Какви въпроси ще изникнат в ума ти, както и в ума на другите учени?

Най-големият въпрос засяга именно репликацията. Двойно-спиралната структура подсказва как протича копирането

^{1, 2}

. Изглежда сякаш двете спирали се разплитат по време на репликация и служат като модел за създаването на друга, напълно еднаква спирала.

Така ли се случва наистина? Отговорът е да! В тази статия ще разгледаме един от най-известните експерименти в биологията, понякога наричан „най-красивият от всички“, който разкрива полуконсервативния механизъм на репликация — чрез който се създават ДНК молекули с по една стара и една нова верига

^{3}

Трите модела на репликацията на ДНК

След откритието на ДНК структурата са предложени три модела на репликацията. Те са илюстрирани на долната диаграма:

_Изображение, модифицирано от "Основи на ДНК репликация: Фигура 1", от Колеж ОупънСтакс, Биология (CC BY 3.0)._

Полу-консервативна репликация. При този модел двете вериги на ДНК се разделят една от друга и всяка от тях служи за модел, по който се създава нова, допълваща я (наричана комплементарна на нея) верига. В резултат на това се получват общо две ДНК молекули, всяка с по една оригинална и една новосъздадена верига.
Консервативна репликация . При този модел на ДНК репликация се получава една молекула, в която са запазени и двете оригинални вериги на ДНК (това е първоначалната ДНК молекула) и още една молекула, съставена от две новосъздадени вериги (тя е копие на оригиналната молекула).
Дисперсионна репликация. При дисперсионния (разсейващ) модел на ДНК репликацията се получават две ДНК молекули, като всяка от тях е смес или „хибрид“ между родителска и дъщерна ДНК. При този модел всяка отделна верига е сглобена като мозайка от фрагменти на оригиналната ДНК и на новосъздадената.

Повечето биолози по онова време биха заложили на полуконсервативния модел. Този тип репликация е логичен предвид двойноспиралната структура на ДНК, според която двете ДНК вериги са напълно и предвидимо комплементарни една на друга (на всяка Т-база на едната верига отговаря А-база на другата; на всяко G отговаря C и обратно)

^{2, 4}

. При такова съответствие е лесно да си представим как всяка верига става модел за синтезирането на неин нов партньор.

Въпреки това биологията изобилства от примери как „най-очевидното“ решение се оказва, че не е правилно. (Спомняш ли си какво стана с Протеините като генетичен материал?). Затова било изключително важно да се определи експериментално кой модел наистина се използва от клетките, когато репликират своята ДНК.

Меселсън и Стал решават загадката

Матю Меселсън и Франклин Стал се срещат за пръв път през лятото на 1954, в годината след публикуването на статията на Уотсън и Крик за структурата на ДНК. Макар научните интереси на двамата учени да се различавали, те се запалват от въпроса за ДНК репликацията и решават да работят заедно, за да опитат да определят механизма на репликацията

^{5}

Експериментът на Меселсън-Стал

Меселсън и Стал провеждат своите придобили известност експерименти върху ДНК репликацията, като използват за моделна система бактерията ешерихия коли (E. coli).

Започват, като отглеждат E. coli в хранителна среда, която съдържа „тежък“ изотоп на азота,

^{15} N

. (Изотопите са варианти на един и същ химичен елемент, които имат различен брой неутрони в ядрото си.) Отглеждана в такава среда, бактерията поема от „тежкия“ азот

^{15} N

и го използва при синтеза на нови биологични молекули, включително на ДНК.

След като няколко поколения бактерии били отглеждани в среда с

^{15} N

, всички азотни бази в ДНК на бактериите съдържали тежък азот

^{15} N

– с други думи, били маркирани с него. След това бактериите са прехвърлени в среда, съдържаща „лекия“ изотоп на азота

^{14} N

, където да се развиват за няколко поколения. Образуваната след прехвърлянето ДНК трябва да се състои от лекия азот

^{14} N

, тъй като това е единственият азот за синтез на ДНК, наличен в новата среда.

Меселсън и Стал знаели колко често се делят бактериите E. coli и успели да отделят малки проби от всяко поколение бактерии, от които да извлекат и пречистят ДНК. След това измерили плътността на ДНК (и по този начин косвено установили съдържанието на

^{15} N

^{14} N

), като използвали метода на центрофугиране в плътностен градиент.

При този метод различните молекули ДНК се разделят в отделни ивици, като ги завърта при голяма скорост в присъствието на друга молекула, например цезиев хлорид, която образува плътностен градиент от върха към дъното на въртящата се епруветка. Центрофугирането в плътностен градиент позволява да се засекат много малки разлики — като тези между ДНК, маркирана с

^{15} N

и с

^{14} N

_Изображение, модифицирано от "Диаграма на експеримента на Меселсън-Стал англ," от Мариана Руиз Вилареал (обществено достояние)._

Резултати от експеримента

При анализа на ДНК от първите четири поколения бактерии E. coli ивиците се подредили по начина, показан на долната фигура:

Как Меселсън и Стал интерпретирали този резултат? Нека да проследим първите няколко поколения, които дават най-важната информация.

Поколение 0

ДНК, изолирана от клетки в началото на експеримента („Поколение 0“, точно преди преминаването към среда с лек азот

^{14} N

), образува само една ивица след центрофугиране. Този резултат е очакван, защото в този момент ДНК трябва да съдържа само тежък азот

^{15} N

Поколение 1

ДНК, изолирана след едно поколение (след една репликация на ДНК), също образува само една ивица при центрофугиране. Обаче тази ивица се намира по-високо в плътностния градиент, по средата между плътностите на ДНК само с тежък азот

^{15} N

и само с лек азот

^{14} N

Това средно положение на ивицата показало на Меселсън и Стал, че получените след първата репликация молекули са хибридни между лека и тежка ДНК. Този резултат отговаря на дисперсионния и полу-консервативния модел, а противоречи на консервативния модел.

При консервативния модел щяха да се получат две отделни ивици в това поколение (една за тежката първоначална молекула и една за новосъздадената лека молекула).

Поколение 2

Информацията от второто поколение помогнала на Меселсън и Стал да определят кой от оставащите два модела (полуконсервативен или дисперсионен) отговаря на реалността.

При центрофугиране на ДНК от второто поколение се образуват две ивици. Едната е на същото междинно място като ивицата от първото поколение, а другата е по-високо (изглежда е маркирана единствено от лекия азот

^{14} N

Този резултат показал на Меселсън и Стал, че репликацията на ДНК протича съгалсно полуконсервативния модел. Разположението на двете отделни ивици — една на мястото на хибридната молекула и една на мястото на леката молекула — е точно каквото се очаква при полуконсервативна репликация (това е изобразено на фигурата по-долу). За разлика от това при дисперсионния модел всички молекули ще съдържат фрагменти и от старата, и от новата ДНК, затова не би се получила „напълно лека“ молекула.

_Изображение, модифицирано от "Основи на ДНК репликация: Фигура 2", от Колеж ОупънСтакс, Биология (CC BY 3.0). Оригинално произведение от "Диаграма на експеримента на Меселсън-Стал англ.," от Мариана Руиз Вилареал (обществено достояние)._

Поколения 3 и 4

При полуконсервативния модел всяка хибридна ДНК молекула от второто поколение се очаква да образува в третото поколение по една хибридна и по една лека молекула, докато всяка лека ДНК молекула ще породи само други леки молекули.

По тази причина очакваме в третото и в четвъртото поколение хибридната ивица да става все по-тънка (защото ще представлява по-малка част от всички ДНК молекули в пробата), а горната ивица, която отговаря на лека ДНК, да става все по-плътна (защото ще представлява по-голяма част от молекулите).

Както виждаме на фигурата, Меселсън и Стал получили точно такова разположение на ивиците в техните резултати, което потвърждавало хипотезата за полуконсервативен модел на репликация.

Съгласно дисперсионния модел всяка репликирана ДНК молекула трябва да бъде смесица от родителска ДНК (от предишното поколение) и дъщерна ДНК (новосинтезирана по време на репликация). Това изглежда сякаш старата и новата ДНК са нарязани по време на репликация и фрагментите им са разменени помежду си и след това са поставени отново заедно, за да образуват двойни спирали. По този начин във всеки кръг на репликация при дисперсионния модел ще се получават мозаечни молекули с тежки и леки участъци. Мозаечните ДНК ще съдържат все по-голяма и по-голяма част от

^{14} N

с всяка следваща репликация, така че плътността на ДНК постепенно ще намалее с течение на времето и при центрофугиране ще се получи ивица (или размита ивица/петно), която се издига все по-нагоре с всяко поколение.

При консервативния модел, ако започнем с единична „тежка“ (

^{15} N

) ДНК молекула, след един кръг на репликация ще разполагаме с първоначалната тежка ДНК молекула и с още една нова, лека молекула. Ако тези ДНК преминат през втори кръг на репликация, какво ще наблюдаваме? Ще имаме една тежка ДНК молекула и три леки молекули. А след третия кръг на репликация ще се окажем с една тежка и седем леки молекули.

Това означава, че при консервативния модел тежката ДНК никога не изчезва напълно, но много бързо новосинтезираните молекули на лека ДНК стават по-многобройни от нея. Можем също така да видим, че при консервативната репликация никога не се получават хибридни молекули, каквито се наблюдават при другите два модела. Това разграничение позволило на Меселсън и Стал да изключат консервативния модел още след първото наблюдавано поколение.

Заключение

Проведеният от Меселсън и Стал експеримент показва, че репликацията на ДНК протича полуконсервативно, тоест всяка верига от ДНК молекулата служи за модел при синтеза на нова, комплементарна на нея верига.

Макар експериментите на Меселсън и Стал да са били проведени върху бактерията E. coli, сега знаем, че полуконсервативната репликация е универсален механизъм, използван от всички организми на планетата Земя. Дори и точно в този момент някои от твоите клетки реплицират своята ДНК полуконсервативно!

Източници

Тази статия е производна модификация на "Основи на ДНК репликацията," от колеж Оупънстакс, Биология, CC BY 4.0. Изтегли оригиналната статия безплатно на http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@10.53.

Изменената статия е лицензирана под разрешително CC BY-NC-SA 4.0.

Цитирани трудове:

Уотсън, Дж. Д. и Крик, Ф. Х. К. (1953). Структура на дезоксирибонуклеиновата киселина. Nature, 171(4356), 737-738. Получено от http://www.nature.com/nature/dna50/watsoncrick.pdf.
Рийс, Дж. Б., Юри, Л. А., Кейн, М. Л., Васерман, С. А., Минорски, П. В., и Джаксън, Р. Б. (2011). Основният принцип: Сдвояване на бази към шаблонна верига. В Кампбел биология (10-то издание). Сан Франциско, Калифорния: Pearson, 318-319.
Американски институт за биологични науки. (2003). Най-красивото от биологията. http://www.aibs.org/about-aibs/030712_take_the_bioscience_challenge.html.
Уотсън, Дж. Д. и Крик, Ф. Х. К. (1953). Генетични приложения на структурата на дезоксирибонуклеиновата киселина. Nature, 171, 740-741.
Дейвис, T. Х. (2004). Меселсън и Стал: Изкуството на ДНК репликацията. PNAS, 101(52), 17895-17896. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0407540101.

Препратки:

Кар, С. М. (2015). Препаративно ултрацентрофугиране на ДНК в плътностен градиент. Получено от https://www.mun.ca/biology/scarr/CsCl_density-gradient_centrifugation.html.

Дейвис, T. Х. (2004). Меселсън и Стал: Изкуството на ДНК репликацията. PNAS, 101(52), 17895-17896. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0407540101.

Ханавалт, П. К. (2004). Плътността е от значение: Полуконсервативната репликация на ДНК. PNAS, 101(52), 17889-17894. http://dx.doi.org/10.1073/pnas.0407539101.

Меселсън, M. и Стал, Ф. У. (1958). Репликация на ДНК при Escherichia coli. PNAS, 44(7), 671-682. Получено от http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC528642/pdf/pnas00686-0041.pdf.

Нолс, С. Р. (2008). Традиционните методи за CsCl изолиране на плазмидна ДНК чрез ултрацентрофугиране. В Thermo scientific. Получено от https://static.thermoscientific.com/images/D17309~.pdf.

Рийс, Дж. Б., Юри, Л. А., Кейн, М. Л., Васерман, С. А., Минорски, П. В., и Джаксън, Р. Б. (2011). Основният принцип: Сдвояване на основа към шаблонна верига. В Кампбел биология (10-то издание, стр. 318-320). Сан Франциско, Калифорния: Pearson.

Полуконсервативна репликация. (n.d). От DNA learning center. Получено на 27 юли 2016 от https://www.dnalc.org/view/15879-Semi-conservative-replication.html.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Вписване в профила

Сортирай по:

Все още няма публикации.

Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.