Основно съдържание

Курс: Биологична библиотека > Раздел 7

Урок 6: Ензимна регулация

Графики на основи на ензимната кинетика

Как да разчиташ графиките на ензимната кинетика (и как те се създават). Km и Vmax. Конкурентни и неконкурентни инхибитори.

Въведение

Нека си представим, че искаш да си купиш спортна кола. Какво може да искаш да знаеш за различните опции (Ферари, Порше, Ягуар, т.н.), за да решиш коя е най-добра? Един очевиден показател ще е максималната скорост на автомобила. Но може да искаш и по-детайлна информация за представянето на колата, например колко бързо може да ускори от 0 до 100 км. в час. С други думи, вместо само да знаеш максималната скорост, ще искаш да знаеш и кинетиката на това как колата достига тази скорост.

Биохимиците са склонни да мислят по същия начин за ензимите, които проучват. Те искат да знаят колкото е възможно повече за ефектите на един ензим върху скоростта на реакцията, а не просто колко бързо може да работи ензима в един прост сценарий.

Всъщност можеш да имаш огромно количество информация за работата на ензима и как той взаимодейства с други молекули като инхибитори, просто като измериш колко бързо катализира една реакция при серия от различни условия. Информацията от тези експерименти често се представя под формата на графики, така че ще отделим известно време да обсъдим как се правят графиките (и как се прочитат, за да се получи колкото е възможно повече информация от тях).

Графики на кинетиката на действието на ензимите

Графики като тази, показана по-долу (показваща скоростта на реакцията като функция на концентрацията на субстрата), често се използват, за да покажат информация относно кинетиката на действието на ензимите. Те съдържат много полезна информация, но също така могат да бъдат доста объркващи първия път, в който ги види човек. Тук ще се разходим стъпка по стъпка през процеса на създаването и тълкуването на тези графики.

Представи си, че любимият ти ензим е в епруветка и искаш да знаеш повече за това как се държи той при различни условия. Провеждаш серия опити, в които взимаш различни концентрации от субстрата – да кажем, 0 М, 0,2 М, 0,4 М, 0,6 М, 0,8 М и 1 М – и намираш скоростта на реакцията (тоест колко бързо субстратът се превръща в продукт), когато добавиш ензима при всяка от тези концентрации. Разбира се, трябва да внимаваш и да добавиш една и съща концентрация от ензима във всяка епруветка, така че да сравняваш едни и същи количества ензим.

Как определяме скоростта на реакцията? Това, което в действителност ни е нужно, е началната скорост на реакцията, когато тъкмо сме комбинирали ензима и субстрата, и ензимът катализира реакцията колкото може по-бързо при тази определена концентрация на субстрата (защото скоростта на реакцията накрая ще намалее до нула, когато субстратът се изразходи). Така че ще измерим количеството продукт, произведен за единица време в началото на реакцията, когато концентрацията на продукта се повишава линейно. Тази стойност, количеството продукт, произведен за единица време в началото на реакцията, се нарича първоначална скорост, или

V_{0}

, за тази концентрация.

Да кажем, че сме намерили стойностите на

V_{0}

за всички концентрации, представляващи интерес за нас. След това можем да нанесем за всяка концентрация на субстрата съответстващата ѝ скорост

V_{0}

като двойка координати (X; Y). След като нанесем всички двойки (X; Y) за различните концентрации, можем да свържем точките с най-добре прилягащата крива, за да получим съответната крива. За много видове ензими кривата, която получаваме, ще наподобява лилавата линия, показана по-горе: стойностите

V_{0}

нарастват бързо при ниски концентрации на субстрата, а след това се стабилизират на равно плато при високи концентрации на субстрата.

Изображение, модифицирано от "Ензими: Фигура 3", от Колеж ОупънСтакс, Биология (CC BY 3.0).

Това плато се получава, понеже ензимът е наситен, което означава, че всички налични ензимни молекули вече са заети да обработват молекули от субстрата. Всички допълнителни молекули субстрат просто ще трябва да изчакат, докато не се освободи ензимна молекула, така че скоростта на реакцията (количеството продукт, произведен на единица време) е ограничена от концентрацията на ензима. Тази максимална скорост на реакцията е характерна за даден ензим при дадена концентрация и се нарича максимална скорост, или $V_{м а к с}$ ‍.

V_{м а к с}

е стойността Y (големината на началната скорост на реакцията), при която кривата след нея достига плато.

Концентрацията на субстрата, при която се наблюдава скоростта, която е на половината разстояние до

V_{м а к с}

, се нарича $K_{m}$ ‍ и е полезна мярка за това колко бързо се увеличава скоростта на реакцията с увеличаване на концентрацията на субстрата.

K_{m}

също е мярка за афинитета на ензима (тенденцията да се прикрепя) към субстрата. По-ниско

K_{m}

съответства на по-висок афинитет към субстрата, докато по-високо

K_{m}

съответства на по-нисък афинитет към субстрата. За разлика от

V_{м а к с}

, която зависи от концентрацията на ензима,

K_{m}

винаги е една и съща за даден ензим и характеризира дадената реакция (въпреки че експериментално измерената стйност на

K_{m}

може да се променя под влиянието на инхибитори, както ще обсъдим по-долу).

Кинетични криви на действието на даден ензим и влияние на инхибиторите

А какво да кажем за инхибиторите? Обсъдихме два вида инхибитори, конкурентни и неконкурентни, в статията за ензимна регулация.

Конкурентните инхибитори понижават напредъка на реакцията, като се прикрепват към даден ензим, често към активния му център, и не позволяват на същинския субстрат да се прикрепи. Във всеки даден момент само конкурентният инхибитор или субстратът може да е свързан с ензима (не и двете). Тоест инхибиторът и субстратът се конкурират за ензима. Конкурентното инхибиране действа като намалява броя на молекулите на ензима, които са достъпни за прикрепване на субстрата.
Неконкурентните инхибитори не пречат на субстрата да се свързва към ензима. Всъщност инхибиторът и субстратът не влияят един на друг за прикрепването към ензима. Но когато инхибиторът се свърже, ензимът не може да катализира реакцията, за да произведе продукт. Следователно неконкурентното инхибиране действа като намалява броя функционални ензимни молекули, които могат да осъществят реакция.

За да покажем ефекта от действието на тези инхибитори на графика като тази по-горе, можем да повторим целия експеримент още два пъти: веднъж с определено количество конкурентен инхибитор, добавен към всяка тестова реакция, и веднъж с определено количество неконкурентен инхибитор, добавен към реакцията. Ще получим следните резултати:

Изображение, модифицирано от "Ензими: Фигура 3", от Колеж ОупънСтакс, Биология (CC BY 3.0).

В присъствието на конкурентен инхибитор реакцията евентуално ще стигне до нормалното си $V_{м а к с}$ ‍, но е нужна по-голяма концентрация от субстрата, за да стигнем до там. С други думи, $V_{м а к с}$ ‍ не се променя, но $K_{m}$ ‍ е по-високо. Защо трябва да бъде добавен още субстрат, за да достигнем $V_{м а к с}$ ‍? Допълнителното количество субстрат води до изобилие от молекули на субстрата, достатъчни постоянно да "побеждават" молекулите на инхибитора за ензима.
В присъствието на неконкурентен инхибитор реакцията никога не може да достигне до нормалното си $V_{м а к с}$ ‍, без значение от това колко субстрат ще добавим. Едно подмножество от ензимни молекули винаги ще бъде "отровено" от инхибитора, така че ефективната концентрация на ензима (която определя $V_{м а к с}$ ‍) е намалена. Но реакцията достига половината от новата си стойност $V_{м а к с}$ ‍ при същата концентрация на субстрата, така че $K_{m}$ ‍ не се променя. Непромененото $K_{m}$ ‍ отразява това, че инхибиторът не засяга прикрепването на ензима към субстрата, а просто намалява концентрацията на използваемия ензим.

Неконкурентните и конкурентните инхибитори са две ясно разграничени категории инхибитори, които имат добре определено кинетично поведение, затова те често се разглеждат във въвеждащите курсове по биология. Но има и други видове инхибитори, които влияят по различен начин на

V_{м а к с}

K_{m}

Различните видове инхибитори са разграничени по това дали се прикрепват само към свободния ензим, само към ензим-субстратния комплекс или и към ензима, и към ензим-субстратния комплекс (както и по относителния им афинитет към тези две форми). За повече информация за инхибиторите и теорията за поведението им, моля, виж раздела Ензимна кинетика на Михаелис-Ментен.

Да обобщим накратко някои главни категории инхибитори:

Конкурентен инхибитор, както е споменато по-горе, се прикрепва само към свободния ензим (и не може да се прикрепи към ензим-субстратния комплекс). Конкурентният инхибитор не засяга $V_{м а к с}$ ‍, но увеличава $K_{m}$ ‍.
Неконкурентоспособен инхибитор (не е същото като неконкурентен инхибитор!) се прикрепя само към ензим-субстратния комплекс, а не към свободния ензим. Неконкурентноспособният инхибитор намалява $V_{м а к с}$ ‍ и намалява явното $K_{m}$ ‍.
Смесен инхибитор проявява поведение между това на конкурентния и неконкурентноспособния инхибитор. Прикрепя се и към свободния ензим, и към ензим-субстратния комплекс, но има по-висок афинитет към (тенденция да се прикрепя към) единия вид, отколкото към другия. Смесените инхибитори постоянно намаляват $V_{м а к с}$ ‍, но може или да увеличат, или да намалят $K_{m}$ ‍, в зависимост от това към коя форма на ензима (свободния или свързания със субстрат) се прикрепят по-силно $^{1}$ ‍.
Неконкурентен инхибитор, както е споменато по-горе, се прикрепя и към свободния ензим, и към ензим-субстратния комплекс и не нарушава равновесието помежду им. (С други думи, има еднакъв афинитет и към ензима, и към ензим-субстратния комплекс.) Неконкурентното инхибиране е специален случай на смесено инхибиране, при което инхибиторът се прикрепя и към ензима, и към ензим-субстратния комплекс с еднакъв афинитет. Чистото неконкурентно инхибиране намалява $V_{м а к с}$ ‍, но не променя $K_{m}$ ‍ $^{1}$ ‍.

Кинетика на Михаелис-Ментен за алостерични ензими

Много ензими действат подобно на хипотетичния ензим в примера по-горе. При представяне на скоростта на реакцията като функция от концентрацията на субстрата, се получават параболични криви. Ензими, които проявяват това поведение, често могат да бъдат описани от едно уравнение, което свързва концентрация на субстрата, начална скорост,

K_{m}

V_{м а к с}

. Това е така нареченото уравнение на Михаелис-Ментен. Ензими, чиято кинетика се подчинява на това уравнение, са наречени ензими на Михаелис-Ментен. Ако искаш по-детайлен поглед върху уравнението на Михаелис-Ментен и модела зад него, можеш да разгледаш видеата върху Михаелис-Ментен в раздела MCAT.

Ензимите на Михаелис-Ментен се различават от алостеричните ензими (които обсъдихме в основната статия за ензимна регулация). Алостеричните езими обикновено имат множество активни центрове и често проявяват кооперативност, което зоначава, че прикрепянето към субстрата към един активен център увеличава способността на другите активни центрове да прикрепват и обработват субстрати.

Кооперативните ензими са по-чувствителни в отговора си към промени в концентрацията на субстрата от други ензими и проявяват "подобен на превключвател" преход от ниска към висока скорост на реакцията, когато концентрацията се увеличава. Това съответства на кинетична крива на отношението скорост/субстрат, която е с S форма, както е показано по-горе.

Източници

Тази статия е производна модификация на "Ензими" от Колеж ОупънСтакс, Биология (CC BY 3.0). Изтегли оригиналната статия безплатно на http://cnx.org/contents/185cbf87-c72e-48f5-b51e-f14f21b5eabd@9.85.

Изменената статия е лицензирана под разрешително CC BY-NC-SA 4.0.

Цитирани трудове:

Брант, М., (2010). Кинетика на инхибирането. В Уебсайт по биохимия CHEM 330, 81. Взето от https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.

Препратки:

Бърг, Дж. М., Тимошко, Дж. Л., и Стрейър, Л. (2002). Моделът Михаелис-Ментен обяснява кинетичните свойства на много ензими. В Biochemistry (5то изд., раздел 8.4). Ню Йорк, Ню Йорк: W. H. Freeman. Получено от http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22430/.

Берг, Дж. М., Тимошко, Дж. Л. и Стрейър, Л. (2007). Ензимите могат да бъдат инхибирани от специфични молекули. В Биохимия (6-то изд., раздел 225-234). Ню Йорк, Ню Йорк: W. H. Freeman.

Брант, М., (2010). Кинетика на инхибирането. В Уебсайт по биохимия CHEM 330, 80-83. Взето от https://www.rose-hulman.edu/~brandt/Chem330/Inhibition_kinetics.pdf.

Гутиерез, Р. (2011). Био41 Седмица 5 - Биохимия Лекции 4-6. Biosci 41, Станфорд.

Смесено инхибиране. (4 декември 2015). Взето на 15 февруари 2016 от Уикипедия: https://en.wikipedia.org/wiki/Mixed_inhibition.

Неконкурентно инхибиране. (2 декември 2015). Взето на 15 февруари 2016 от Уикипедия: https://en.wikipedia.org/wiki/Non-competitive_inhibition.

Искаш ли да се присъединиш към разговора?

Вписване в профила

Сортирай по:

Все още няма публикации.

Разбираш ли английски? Натисни тук, за да видиш още дискусии в английския сайт на Кан Академия.