Гел електрофореза

Да речем, че имаш няколко епруветки тук, които съдържат разтвори с фрагменти от ДНК. Нека видим какви ли фрагменти има в тази първата епруветка, в епруветка номер 1. Колко са дълги тези фрагменти? Колко базови двойки имат? Колко са дълги те? Може би ще си кажеш: "Добре, защо просто не ги извадим и преброим?" Само че те са невероятно малки и е ужасно трудно да се борави с тях. Дори относително голям фрагмент от ДНК, да речем, че говорим за нещо от порядъка на 5000 базови двойки, ако го изправиш напълно, ще има дължина приблизително от 1 до 2 микрометъра. И дори не можем да си представим колко малък ще бъде реалният диаметър, но по отношение на дължината ще бъде един или два микрометра. Което е супер миниатюрно. Това е една или две хилядни от милиметъра. Това няма да ни помогне да боравим с него с ръце. Или с някакви твърди инструменти. Тогава как постъпваме? Може би имаме и други епруветки. Как разбираме точно колко дълги са ДНК-веригите в тези епруветки? Методът, който ще използваме, се нарича гел електрофореза, която може да се използва за ДНК вериги, РНК вериги, може да се ползва и за протеини, за която и да е от тези молекули, за да се види колко дълги са фрагментите. Нека запиша това. Гел електрофореза. Нарича се гел електрофореза, защото включва гел, електрически заряд, а "фореза" се отнася просто до това, че ще накараме ДНК-фрагментите да мигрират през гела под действието на заряда. Фореза се отнася за миграцията или движението на самата ДНК. Как правим това? Това е нашето устройство ето тук. Имаме нашия гел вътре, който е част от буферен разтвор. Най-типичният гел е агарозата, вид полизахарид, получен от водорасли. Това буквално е гел. Желеподобен материал е. Това, което ще направим, е да вземем проби, малка проба от тази епруветка ето тук и да я сложим в това гнездо ето тук. Това са малки вдлъбнатини в гела. Можеш да вземеш малка проба от тази епруветка и да я поставиш в това гнездо. И после можеш да вземеш проба от тази епруветка и да я поставиш в това гнездо. Те ще бъдат покрити от буфера. Можеш да го видиш нарисуван, тази течност. Това е просто вода с някакви соли. Буферът ще спомогне pH-то да остане в желаните граници, когато пуснем заряд през цялото това нещо. Защото, ако pH се промени твърде много по посока към киселинност или основност, може да окаже влияние на ДНК-то или на неговия заряд. Сега ще пуснем заряд през цялото устройство. От страната с гнездата, където е сложено ДНК-то – тук ще сложим отрицателния електрод. Това тук е отрицателният електрод. На другия край ще бъде положителният електрод. И ще използваме факта, че ДНК има отрицателен заряд при обичайното си pH, това pH, с което работим. Сега можем да се върнем към изображение от предишни видеа и да го видим ето тук. Виждаш тези отрицателни заряди на фосфатната верига. Така, какво ще се случи? Какво ще стане, когато свържем тези два електрода към източник на напрежение? Това е отрицателната страна, а тази положителната. ДНК-то ще иска да се придвижи. Нека помислим как ще се случи това. По-далеч ли ще се придвижат по-късите неща, или по-дългите ще отидат по-далеч? Може би ще си кажеш: "По-дългите неща имат по-голям отрицателен заряд, така че вероятно те ще отидат по-далеч." Но трябва да помниш, че те движат и по-голяма маса. Затова техният заряд по маса ще бъде същият, независимо от дължината. Какво определя колко далече ще стигне нещо, колко се придвижва за определен период от време? Това е колко малко е то. Спомни си, имаме този агарозен гел. Хората все още изучават точния механизъм как това ДНК, или тези молекули, всъщност мигрират през полизахарида. Но ако си представиш този полизахарид като една мрежа, като една цедка – по-малките неща ще могат да преминат през пролуките по-лесно от по-големите. Ако оставиш да мине някакво време, част от ДНК-то – да речем това ДНК – ще стигне дотук. Просто слагам цветове, всъщност няма да ги виждаш така. И да речем това ДНК стига дотук. Не стига чак толкова напред. Да речем, че това ДНК не се придвижва толкова. Да кажем, че част от него стига дотук, и част мигрира дотук. След това изчакваш малко време и като се върнеш, виждаш тази миграция. Ще видиш, че се е случила тази миграция. И колкото повече чакаш, толкова по-надалече ще стигнат тези. Всъщност ако изчакаш твърде дълго, те ще паднат през другия край. Като видиш това, си казваш: "Добре, тази нишка тук – би трябвало да са по-малки ДНК-молекули. Трябва да са по-къси. Тези трябва да са малко по-дълги, а тези дори още по-дълги. Тази група тук ще да е най-дългата от всички." Това е била смес от по-дълги нишки, и пак по-дълги, но не чак толкова. И примерно е имало съвсем къси фрагменти, съвсем къси – ето тук. Рисувам ги като тази оранжева група ето тук. Това, което направих току-що, може да ти покаже относителната дължина на веригите. Как точно ги измерваме? Като използваме стандартизирани разтвори, които наричаме ДНК-маркери. Да речем, че имаш ДНК маркера. Ще го нарисувам в розово. Можеш буквално да го купиш. Можеш да го купиш онлайн. И стандартният разтвор, да речем, че се разделя ето така. Това отива тук, част от него стига тук, и част тук. Тогава ще можеш да разбереш от маркерите, в зависимост какво си купил, че тази група тук, това ДНК има 5000 базови двойки например. Да кажем, че това тук има 1500 базови двойки. А това тук например е дълго 500 базови двойки. Сега можеш да използваш тези ДНК маркери, тези стандартизирани маркери, за да измериш колко базови двойки са това. Това синьото тук – това е група ДНК, малко по-дълга от 500 базови двойки. Но е по-къса от 1500 базови двойки. Можеш да вземеш това зеленото, то е малко по-дълго от 1500 базови двойки, не е мигрирало толкова далеч, колкото този голям пакет от 1500. Така можеш да получиш по-добро приближение. И можеш да избереш маркера според това какво очакваш да откриеш тук, какво точно търсиш. Другото нещо, което трябва да отчетем, когато видим, че ДНК е мигрирало толкова далеч: това една ДНК верига ли е, една ДНК нишка ли наблюдавам? Връщам се към мерките. Това са много, много, много ДНК, които наблюдаваш. Те не са всички така издължени. Помни, че дори нещо, което е с дължина 5000 двойки, е един или два микрометра, ако го разтеглиш. Така че дори няма да можеш да ги виждаш, това е една хилядна от милиметъра. Дори няма да можеш да го видиш. Това са много, много, много молекули ДНК, които са се придвижили до тук. И дори не трябва да са чак толкова малки, за да могат да мигрират през полизахаридния гел. Последното нещо, което сигурно си казваш, е: "Чакай, как тогава го виждам ето тук? Как реално виждам това ДНК? Особено ако това са толкова дребни молекули." Отговорът е, че слагаш някаква маркировка на ДНК-то, която ще ги направи видими. Някаква боя например, или нещо флуоресцентно. Едно от често използваните неща е етидиев бромид. Етидиевият бромид се нарича реагент за интеркалация. Това е молекула. Можеш да я видиш тук. Това са две ДНК вериги, можеш да видиш базовите двойки, свързани тук. А това тук е етидият, който се е вклинил. Затова го наричаме интеркалация. Вклинил се е между стъпалата на стълбата. Когато се внедри по този начин вътре в молекулата, тя става флуоресцентна под UV светлина. Ако сложиш този етидиев бромид във всичките ДНК ето тук, и те мигрират, а после включиш UV светлина, те ще станат флуоресцентни. И ще можеш да ги видиш. Ако искаш да разбереш как би изглеждало в действителност – изглежда ето така. Ако го гледаш директно. Това тук ще да е гнездото. Нека го направя по-добре четимо. Това тук ще е гнездото, където си сложил ДНК-маркерите, и ще излязат стандартизираните дължини. Може би това са 5000 двойки, това 1500, а това тук 500 базови двойки. И да речем, че имаш разтвор на друго ДНК. Изчакваш малко. След това виждаш, че то е мигрирало чак до мястото с 500 базови двойки. Значи трябва да е група от неща малко по-дълги от 500 двойки. Но със сигурност доста по-малко от 1500 базови двойки. Още веднъж: не е задължително да имаш само една дължина. Може да си имал друга група, която е точно 1500 двойки. И сигурно си го виждал, когато чуеш хора да говорят за генен анализ и подобни неща. Често виждаш хора да разглеждат тези разпечатки от гел електрофорези. Как знаеш какво точно се случва тук? Това не е една нишка ДНК, това е голяма група от ДНК, която е маркирана с някаква боя или етидиев бромид или др. Това е пакет от тези молекули и те са мигрирали въз основа на заряда. Те се опитват да избягат от отрицателния заряд към положителния. Най-малките молекули, това е група от малки молекули ето тук, успяват да стигнат най-далеч, защото могат да се промушат през решетката на агарозния гел.